巢湖半汤温泉中菌株CHBT-1721产淀粉酶性质初步研究

方 舒，严 鹏，周培培

（巢湖学院化学与材料工程学院，安徽巢湖238000）

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，是一种能使糖原水解和催化淀粉转化为葡萄糖、麦芽糖等糖类及一系列其它低聚糖的酶类，能使淀粉分子中的α-1,4糖苷键或β-1,6糖苷键发生水解[1-3]。淀粉酶大部分存在于微生物和动植物中，其中微生物的酶几乎都是分泌的，为酶液的分离提供了便利[4]。淀粉酶制剂是最早实现工业化生产的酶制剂，产量最多，广泛应用于食品加工、发酵工业、医药行业、酿造产业、化学工艺、饲料工业等多种领域[5-7]。淀粉酶是一种生物活性催化剂，需要在特定的温度、pH等条件下才能正常发挥酶活性，为了提高淀粉酶活性，保障较高的淀粉转化效果，研究淀粉酶的反应条件对淀粉酶的工业化应用具有重要的意义[8-9]。最早实现工业化生产的酶制剂由于淀粉的糊化温度较高，使用的淀粉水解酶一般均需要耐受较高的温度。温泉是筛选嗜热菌的微生物资源库，从中筛选具有产耐热淀粉酶的细菌几率很大，我国科学家通过对云南腾冲温泉中嗜热微生物资源的多样性研究，已筛选出大量有应用价值的耐热型细菌[3,10-13]。

安徽巢湖半汤温泉系全国四大温泉之一，大小泉眼，星罗棋布。最大的有两口，一为烫泉，一为冷泉，两泉汇合为温泉，故名“半汤”。其中热泉水温60℃，日流量1 000吨左右，冷泉水温40℃，日流量10 000多吨。

本研究拟对之前实验室筛选自巢湖半汤温泉的一株产淀粉酶的嗜热菌株CHBT-1721进行初步的酶学性质研究，为后期的工业化应用提供一定的科学依据[14]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

实验室保藏的一株筛选自巢湖半汤温泉中的嗜热菌株CHBT-1721。

1.1.2 培养基

产淀粉酶培养基（g/1 000 mL）：蛋白胨10，牛肉膏5，可溶性淀粉2，NaCl 5，蒸馏水1 000 mL，调节pH为7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min，上述培养基中加入15～20 g琼脂粉即制成产淀粉酶固体培养基。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化

在超净工作台上用灭菌后的接种环将斜面保藏的菌株CHBT-1721经平板划线法接种到平板上，放入50℃的恒温培养箱中倒置培养[15]。24 h后向平板的表面滴加少量卢戈氏碘液，混匀、若菌落的周围观察到无色透明的水解圈，说明淀粉被水解了，则该菌株已被活化并且是产淀粉酶菌株[16-17]。活化后的菌株CHBT-1721通过斜面传代法短期保藏于-4℃冰箱中，备用。

1.2.2 淀粉酶活力的测定

淀粉酶活力的测定采用DNS比色法，淀粉酶催化产生的还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力[18]。

1.2.2.1 麦芽糖标准曲线的制作

麦芽糖标准曲线的制作按照表1进行。

表1 标准麦芽糖溶液吸光度值的测定

1.2.2.1 粗酶液的制备

无菌操作接种少量菌株CHBT-1721到100 mL产淀粉酶液体培养基中，120 r/min恒温振荡培养，48 h后将上述菌液转移到离心管中，4 000 r/min离心20 min，取上清液保存于洁净离心管中，-20℃保藏备用，即为粗酶液。

酶活定义：上述条件下以单位体积样品在30 min释放1 mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位（MMU）表示酶活性。

1.2.3 粗酶液活性与温度、pH、金属离子和茶碱的关系

在波长为520 nm的条件下用分光光度计测定菌株CHBT-1721所提取粗酶液在温度（30，35，40，45，50，55，60）℃、pH（3，4，5，6，7，8，9，10，11）、金属离子（Zn2+、Mg2+、K+、Fe2+、Cu2+）和茶碱（3，6，9，12）mmol/L下的吸光度值，并根据公式计算各研究条件下的淀粉酶活力，绘图。

2 结果与分析

2.1 淀粉酶活力的测定

2.1.1 麦芽糖标准曲线的绘制

根据实验原理，利用不同浓度的麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应测得在波长为520 nm下的吸光度值，并以吸光度值为纵坐标，麦芽糖含量为横坐标作图1，即为麦芽糖标准曲线图，公式为：

y=0.4893，x-0.0434，R2=0.9935。

图1 麦芽糖标准曲线

2.1.2 淀粉酶活力

表2 酶活力测定

2.2 酶学性质研究

2.2.1 温度对酶活力的影响

由图2可知淀粉酶活力的最适温度范围为40～50℃，淀粉酶最适反应温度是45℃，且温度高于60℃时，酶活力急剧下降。

2.2.2 pH值对酶活力的影响

由图3可知淀粉酶活力的最适pH范围为6～8，淀粉酶最适pH是7，符合淀粉酶是胞内酶的定性。

2.2.3 金属离子对酶活力的影响

由图4可以看出在2 mmol/L浓度下的金属离子对淀粉酶活性的影响，Mg2+、K+均对淀粉酶活性有促进作用，而K+的促进作用最大，Zn2+、Cu2+、Fe2+均对淀粉酶活性有抑制作用，而Zn2+的抑制作用最明显。

2.2.4 茶碱对酶活力的影响

由图5可以看出茶碱对淀粉酶有抑制作用，且随着浓度的增加而增强。

图2 不同温度下的相对酶活

图3 不同pH值下的相对酶活

图4 不同金属离子下的相对酶活

图5 不同浓度茶碱下的相对酶活

3 结论

该研究对实验室保藏的一株产淀粉酶嗜热菌株CHBT-1721的酶学性质进行了初步研究，菌株CHBT-1721的淀粉酶活性受到温度、pH值、金属离子、茶碱因素的影响。实验结果表明，温度和pH值对淀粉酶活性的影响非常显著，最适温度和最适pH值的测定对酶的应用研究具有重要的意义。不同菌株的生长温度不同，其所产淀粉酶的最适反应活性温度也是不一样的，淀粉酶活性的最适pH值受酶来源影响，一般细菌来源的淀粉酶活性的pH值范围是6～7[19]。另外不同金属离子对淀粉酶的活性也有影响，该研究中，K+、Mg2+均有促进作用，Fe2+抑制作用较弱，Cu2+、Zn2+抑制明显，推测Cu2+、Zn2+可以破坏酶蛋白质的结构。茶碱是黄嘌呤甲基衍生物，是一类具有显著生理作用的生物碱存在于茶叶中，本研究中发现茶碱随着浓度的增加，其抑制淀粉酶活性的作用逐渐增加，这与刘雯等[20]的研究结果也是一致的。

菌株CHBT-1721所产淀粉酶的反应条件温和适合工业生产，不仅对淀粉酶库有了进一步扩充，而且使淀粉酶工业生产多了一种选择。后续拟对该酶的蛋白质结构与基因表达进行研究，使该酶能适应复杂的工业环境，提高该酶的应用价值。