辣木叶提取物对胰脂肪酶活性的抑制研究

钟英英，谢勇鹏，郭莎莎，魏小月，寿瑾，叶云

（广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006）

辣木（Moringa oleifera Lam．）为辣木科、辣木属植物，起源于印度北部的亚喜马拉雅山地带。近年来，辣木在我国广东、云南、海南等都有引种栽培。2012 年辣木叶被中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会批准为新资源食品。目前国内外的研究证明辣木叶提取物具有降低糖耐量、降血糖、降血脂等作用[1]。

胰脂肪酶主要来源于胰腺腺泡细胞，当人体进食后，食物中的脂肪会被胰脂肪酶水解成小分子，被人体吸收后再次重新合成人体脂肪。因此，抑制体内胰脂肪酶活性可有效地抑制体内脂肪的吸收和水解，减少脂肪的沉积，达到预防与治疗肥胖的目的[2]。植物来源的天然化合物具有安全性高、来源广泛等特点，从植物中筛选新的、副作用更小的胰脂肪酶抑制剂一直是研究热点[3-5]。本研究主要分析不同条件下辣木籽浸提物对胰脂肪酶活力影响的变化趋势，通过酶动力学分析考察其对胰脂肪酶抑制类型，为综合利用辣木叶提供了新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

辣木叶：产于湖南省月山城，除杂后粉碎，过80 目筛，密封阴暗处保存备用；胰脂肪酶（1 500 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；苯、乙醇（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、吡啶、醋酸铜（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 不同因素所得提取物对脂肪酶活性的影响

1.2.1.1 不同乙醇浓度所得提取物对脂肪酶活性的影响

精密称取辣木叶粉5 份，每份1.000 g，分别加入40%、50%、60%、70%、80% 乙醇 40 mL，在超声功率为 400 W，料液比为 1 ∶40（g/mL）,提取 500 s。所得提取液进行抽滤，用旋转蒸发仪浓缩至40 mL，分别测定其抑制率。

1.2.1.2 不同提取时间所得提取物对脂肪酶活性的影响

精密称取辣木叶粉7 份，每份1.000 g，提取时间为200、300、400、500、600、700、800 s，超声功率为 400 W，料液比为 1 ∶40（g/mL），50 ℃，加入 50%乙醇 40 mL 进行提取。所得提取液进行抽滤，用旋转蒸发仪浓缩至40 mL，分别测定其抑制率。

1.2.1.3 不同超声功率所的提取物对脂肪酶活性的影响

精密称取辣木叶粉5 份，每份1.000 g，于超声功率为 100、200、300、400、500 W，料液比为 1 ∶40（g/mL），50 ℃，50%乙醇40 mL 提取500 s。所得提取液进行抽滤，用旋转蒸发仪浓缩至40 mL，分别测定其抑制率。

1.2.1.4 不同液料比所得提取物对脂肪酶活性的影响

精密称取辣木叶粉 5 份，每份 1.000 g，按照 1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL）的料液比，加入 50%乙醇，在超声功率400 W，50 ℃，提取500 s。所得提取液进行抽滤，用旋转蒸发仪浓缩至40 mL，分别测定其抑制率。

1.2.1.5 不同提取温度所得提取物对脂肪酶活性的影响

精密称取辣木叶粉5 份，每份1.000 g，在温度为 40、50、60、70、80 ℃，加入 50 % 乙醇，在料液比为1 ∶40（g/mL），，超声功率 400 W，提取 500 s。所得提取液进行抽滤，用旋转蒸发仪浓缩至40 mL，分别测定其抑制率。

1.2.2 正交试验及验证试验

在单因素试验的基础上，选择影响提取较大的3个因素，以胰脂肪酶活力的抑制率为指标，设计正交试验表，确定最佳提取条件。

1.2.3 胰脂肪酶活力测定

参考文献[6-7]的方法，略作修改。KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液（pH 7.4）3 mL 和橄榄油 1 mL，37 ℃预热10 min 后加入2 mL 酶液，搅拌10 min 后加入8 mL苯，继续搅拌2 min 后终止反应，萃取生成脂肪酸。离心10 min，取4 mL 有机相，加入显色剂（5%醋酸铜溶液pH 6.1）1 mL，搅拌3 min，使产生的脂肪酸与Cu2+充分反应生成绿色络合物。离心10 min，取上层溶液，710 nm 处测吸光度。同法制备不含脂肪酶溶液作为参比。

胰脂肪酶的酶活计算公式如下：

式中：X 表示胰脂肪酶的酶活力，U/mL；c 为脂肪酸浓度，μmol/mL；V 为脂肪酸溶液体积，mL；V′为胰脂肪酶的用量，mL；t 为反应时间，min。

1.2.4 辣木叶提取物对胰脂肪酶活性的抑制

以空白管为空白溶液进行调零，辣木叶提取物对胰脂肪酶活性的抑制率的计算公式如下：

式中：A1为不加样品时吸光值；A2为加入提取物时的吸光值；A3为加入提取物但未加酶和底物的吸光值。

1.2.5 辣木叶提取物抑制类型的研究

在15 mL 反应体系中加入2 mL 10 mol/mL 的胰脂肪酶酶液，在底物添加量分别为0.5 mL 和1 mL 测定不同辣木叶提取物浓度（1、5、10、25、50 mg/mL）胰脂肪酶酶解脂肪的反应速度,以反应速度的倒数（1/V）为纵坐标，辣木叶提取物浓度的倒数（1/S）为横坐标作Dixon 图。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度乙醇提取物对脂肪胰酶活性的影响

不同浓度乙醇提取物对脂肪胰酶活性的影响见图1。

从图1 可以看出，乙醇浓度在40%～70%范围内，抑制率随乙醇浓度增大呈上升趋势，乙醇浓度为70%时，抑制率达到最大。乙醇浓度超过70%后，抑制率随乙醇浓度增大呈下降趋势。可能是因为较低浓度的乙醇溶液不能完全把辣木叶中的有效成分提取出来，而过高浓度的乙醇溶液又会造成提取物中溶于乙醇[8]，导致抑制率下降。

图1 不同浓度乙醇提取物对胰脂肪酶活性的影响Fig.1 Effect of Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity with different ethanol concentration

2.2 不同提取时间所得提取物对胰脂肪酶活性的影响

不同提取时间所得提取物对脂肪胰酶活性的影响见图2。

图2 不同提取时间所得提取物对胰脂肪酶活性的影响Fig.2 Effect of Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity with different time

从图2 可以看出，在300 s～400 s 范围内，抑制率随提取时间延长而呈现明显上升趋势；在400 s～600 s范围内，抑制率随提取时间延长缓慢上升；提取时间为600 s 时，抑制率达到最大值。超过600 s 抑制率则随提取时间延长明显下降。可能是因为时间小于400 s时，辣木叶中的有效成分未被完全提出，而400 s～600 s时，辣木叶提取物与胰脂肪酶的作用趋于饱和状态，600 s 时辣木叶总有效成分基本被完全提取；再延长提取时间，提取出的有效成分被氧化分解或部分有效成分在长时间超声作用下高温降解，使得抑制率呈现下降趋势[9]。故选取最适提取时间为600 s，最适提取时间范围为400 s～600 s。

2.3 不同超声功率所得提取物对胰脂肪酶活性抑制影响

不同超声功率所得提取物对脂肪胰酶活性的影响见图3。

图3 不同超声功率所得提取物对胰脂肪酶活性抑制影响Fig.3 Effect of Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity with different ultrasonic power

从图3 可看出，功率在100 W～300 W 时，抑制率随超声功率增大呈明显上升趋势。在300 W 时，抑制率达到最大值；在300 W～500 W 范围内，抑制率随超声功率增大呈明显下降趋势。可能是因为超声功率在100 W～300 W 范围内时，随超声功率增大，温度逐渐升高，提取出的有效成分增多，使得辣木叶提取物对胰脂肪酶活性抑制增强。功率为300 W 时，辣木叶有效成分可能被完全提取；超过300 W 会导致温度过高，有效成分中的热敏性物质被氧化分解或长时间超声作用下高温降解[6]，使得抑制率呈现下降趋势。故选取最适超声功率为300 W。

2.4 不同料液比对胰脂肪酶活性的抑制

不同料液比所得提取物对脂肪胰酶活性的影响见图4。

图4 不同料液比所得提取物对胰脂肪酶活性抑制影响Fig.4 Effect of Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity with different solid-liquid ratio

从图4 可看出，料液比在 1 ∶30（g/mL）～1 ∶50（g/mL）范围时，抑制率随溶剂体积增大明显上升。料液比为1 ∶50（g/mL）时抑制率达到最大；溶剂体积超过 50 倍时，抑制率随溶剂体积增大呈下降趋势。可能是因为料液比在 1 ∶30（g/mL）～1 ∶50（g/mL）范围时，溶剂体积越大，提取物有效成分被提取出来越多，抑制作用增强。当溶剂体积超过50 倍时，随溶剂体积增大，导致冷凝回流不够充分，提取浓度变大，抑制反应进行并在料液比为1 ∶60（g/mL）时达到平衡状态。故选取最适提取料液比为 1 ∶50（g/mL）。

2.5 不同提取温度所得提取物对胰脂肪酶活性抑制影响

不同提取温度所得提取物对脂肪胰酶活性的影响见图5。

图5 不同提取温度所得提取物对胰脂肪酶活性抑制影响Fig.5 Effect of Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity with different tempreature

从图5 可看出，提取温度在40 ℃～60 ℃范围内，抑制率随提取温度升高呈上升趋势；提取温度为60 ℃时，抑制率达到最大；在60 ℃～80 ℃范围内，抑制率随提取温度升高呈下降趋势。可能是因为提取温度在40 ℃～60 ℃范围内，随着温度的升高，辣木叶提取速率增加，提取效果提高，抑制率也逐渐上升；提取温度在60 ℃时，提取效果最佳；提取温度超过60 ℃时，随提取温度升高，乙醇挥发和提取物中热敏性物质可能被破坏，导致提取效率变低，提取物对胰脂肪酶活性抑制率下降。故选取最适提取温度为60 ℃，最适提取温度范围为 60 ℃～70 ℃。

2.6 正交试验

通过单因素试验，发现超声功率对提取物抑制作用影响不明显，故排除对超声功率的考察，且固定超声功率为400 W。故选取提取温度、乙醇浓度、料液比和提取时间4 个因素进行正交试验，正交试验结果见表1。

表1 辣木叶提取物对胰脂肪酶活性抑制影响正交表Table 1 The result of the orthogonal experiments for Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity

续表1 辣木叶提取物对胰脂肪酶活性抑制影响正交表Continue table 1 The result of the orthogonal experiments for Moringa oleifera leaves extracts on pancreatic lipase activity

由表2 可知，各因素对胰脂肪酶活力抑制的影响顺序依次为：乙醇浓度=提取时间>提取温度>料液比，且最优的组合为C2B3A1D3，即提温度50 ℃、提取时间500 s、乙醇浓度 70%、料液比 1 ∶50（g/mL）。在此条件下进行3 次平行验证试验，抑制率分别为80.36%、78.67%和78.42%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.06%，试验具有可行性。

2.7 抑制常数及抑制类型的确定

含辣木叶提取物的胰脂肪酶反应Dixon 图见图6。

图6 含辣木叶提取物的胰脂肪酶反应Dixon 图Fig.6 Dixon curves of the reaction of pancreatic lipase in the presence of Moringa oleifera leaves extracts

Ki 为抑制常数，即酶-抑制剂复合物的离解常数。Ki 越小，抑制作用越强。由图6 可知，改变提取物浓度，不同底物添加量对反应速度的影响曲线交点横坐标的绝对值为10.71，即辣木叶提取物对胰脂肪酶的抑制常数Ki=10.71 mg/mL，表明辣木叶提取物对胰脂肪酶抑制作用较强。

辣木叶提取物胰脂肪酶反应Lineweaver-Burk 图如图7 所示。

图7 加辣木叶提取物后胰脂肪酶的Lineweaver-Burk 图Fig.7 Lineweaver-Burk curves of the reaction of pancreatic lipase in the presence of Moringa oleifera leaves extracts

底物浓度倒数与反应速度倒数曲线相交于横轴，符合非竞争性抑制的特征[9]。说明辣木叶提取物与酶活性中心以外的其他必需基团进行结合，这种结合不影响胰脂肪酶与底物的结合。胰脂肪酶与底物的结合，也不影响胰脂肪酶与辣木叶提取物的结合[10-11]。而且胰脂肪酶-底物-辣木叶提取物的复合物也不能进一步变成产物。这种类型抑制剂的抑制程度则仅取决于辣木叶提取物的浓度，即底物的浓度不会影响辣木叶提取物对胰脂肪酶的抑制程度。

3 结论

1）经过正交试验，得出辣木叶提取物对胰脂肪酶活性的最佳抑制条件为：提取时间为500 s、提取温度为 50 ℃、乙醇浓度为 70%、料液比为 1 ∶50（g/mL）及超声功率为300 W 时，辣木叶提取物对胰脂肪酶的抑制效果最佳，为79.15%。

2）结合辣木叶提取物对胰脂肪酶活性反应的Dixon 和Lineweaver-Burk 图可知，辣木叶提取物对胰脂肪酶的抑制作用是非竞争性抑制，抑制常数Ki=10.71 mg/mL。表明辣木叶提取物对胰脂肪酶活性抑制作用较强，抑制程度仅取决于辣木叶提取物的浓度。