牦牛肉气味指纹分析及其在鲜度评价中的应用

罗 章 辜雪冬 马美湖 孙术国，3* 耿 放

（1西藏农牧学院食品科学学院 西藏林芝 860000

2华中农业大学食品科技学院 武汉 430070

3中南林业科技大学食品科学与工程学院 长沙 410004）

牦牛是生活于青藏高原地区的一种原始种牛，主要分布在西藏、青海、甘肃、新疆、云南和四川等地，全球92%的牦牛生活于此地区[1-2]，由于海拔高、气候寒冷的气候特点，所以形成了独特的遗传性能[3]。牦牛肉因具有天然无污染、肉质鲜美、风味独特的特点，故近些年来愈来愈受到消费者的青睐[4-5]。在牦牛肉的贮运和消费过程中，新鲜度作为一个综合反映牦牛肉品质及安全性的指标，具有重要的意义[6]。评价牦牛肉新鲜度的检测方法与一般牛肉相似，主要包括感官评价、微生物和理化检测[7]。感官评价易受个体主观因素的影响，而微生物和理化指标的检测存在耗时、费力等缺点[8]。需要寻求一种客观、准确和快速的牦牛肉新鲜度检测方法。

电子鼻（Electronic nose，EN）作为一种集检测、分析和识别复杂挥发性成分等功能于一体的新型仪器，其样品处理简单、检测和分析快捷、试验结果重复性好和自动化程度高等特点，越来越受到食品科研工作者的重视[9-11]。近年来，针对一些富含挥发性成分的样品，出现了基于气味指纹技术的新鲜度检测方法，且已在各种动物制品中进行了应用[12-15]。随贮藏时间的延长，肉类制品新鲜度下降，在此过程总产生较多的挥发性物质，肉的总体气味发生剧烈变化[16]，因而可使用电子鼻对肉类的新鲜度进行辨别和检测。

本试验采用电子鼻分析技术，考察4，25，37℃温度、不同贮藏时间条件下鲜牦牛肉挥发性成分的变化规律；通过对检测数据与感官评定和挥发性盐基氮（TVBN）之间相关性的研究，建立预测牦牛肉新鲜度的数学模型，为利用电子鼻技术快速检测牦牛肉的新鲜度提供理论依据和研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料 牦牛来自西藏区贡布江达县种萨乡天然牧场，选取发育正常、健康无病、年龄在5岁左右的成年公牦牛，宰杀后取大腿肌，冷冻贮运，4℃解冻后用于试验。

1.1.2 主要试剂 氧化镁、硼酸、盐酸、乙醇、甲基红、碳酸钠都为分析纯，次甲基蓝为化学纯，均购买于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器 Fox 4000气味指纹分析仪，法国Alpha MOS公司；Yc-950L冷藏箱，中科美菱低温科技有限公司；GDS-100恒温恒湿试验箱，苏州鑫达试验设备有限公司；HWS-250恒温恒湿培养箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；SW-CJ-2D双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；半定量定氮器，铭泰科教仪器设备有限公司；微量滴定管，武汉玻璃仪器厂；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；DW-FL90/135超低温冰箱，中科美菱低温科技有限公司；SX24-10马弗炉，上海索谱仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牦牛肉的贮藏与取样 取解冻后的牦牛肉，在净化工作台内分割成约15 g的方形小块。将肉块随机分成3组，均匀摆放在托盘中，用保鲜膜覆盖后分别贮藏于4℃冷藏箱、25℃和37℃恒温恒湿箱内。4℃样品每24 h取样一次，共测定7次；25℃和37℃样品每12 h取样一次，共测定5次。取样时，每样品取肉块3块，分别对肉块进行电子鼻检测、感官评定和挥发性盐基氮测定。所有样品均按照“温度-时间”的格式进行编号，如4℃下贮藏12 h的样品编号为“4-12”。

1.2.2 气味指纹分析 取样后将肉块用干净刀具切成肉糜状，准确称取2.00 g样品，装入自动进样瓶中（5 mL），立即压盖封口，使用电子鼻对其进行挥发性成分分析。电子鼻检测参数如下：样品平衡温度45℃，平衡时间为10 min；进样体积2 500 μL，进样时间3 s，进样针温度45℃；载气为洁净干燥空气，流速200 mL/min；数据采集延迟时间180 s，清洗时间90 s。每样品6个平行，每批次样品在取样后1.5 h内完成所有检测[17-20]。

1.2.3 感官评价 该试验选取感官评定成员20人，其中10位是感官经验丰富的专家，其余10人为本课题组经过严格筛选的社会人员。感官评价时样品随机编号，随机评定，每次评定由每个评定成员单独进行，相互不接触交流。在每次取样时对牦牛肉的外观和气味进行描述，具体指标包括色泽、黏度、弹性和气味[21]。在良好的自然光线下，首先对表面色泽、外部状态进行观察，并检查表面气味；然后将肉块切开，嗅其内部气味，用手指按压肉块，感触硬度和黏度，并观察按压后回复的速度和程度。感官评价完成后按照表1的标准[4，22]，对肉块新鲜程度进行判定，若同一样品出现不同判定结果时，以多数人的判定结果为准。

表1 鲜牦牛肉感官评定标准Table 1 The sensory evaluation standards of fresh yak meat

1.2.4 挥发性盐基氮测定 挥发性盐基氮按照GB/T5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中半微量凯氏定氮法进行测定。具体方法如下：剔除样品肉块中的脂肪、筋膜和腱，切成小块后用剪刀剪碎，搅匀后称取约10 g，置于锥形瓶中，加100 mL水，常温下振摇浸渍30 min后过滤；取10 mL硼酸吸收液置于锥形瓶中，加入5～6滴混合指示液，将锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入溶液液面以下，准确吸取5.0 mL上述滤液于蒸馏器反应室内，加5.0 mL氧化镁混悬液（10 g/L），迅速盖塞密闭后进行蒸馏，蒸馏5 min即完成；将吸收液用盐酸标准溶液进行滴定，终点至蓝紫色。同时进行空白试验。滴定重复3次，按下列公式计算结果，保留3位有效数字。

式中，X——样品中挥发性盐基氮的值；V1和V2分别为空白和样品消耗盐酸标准溶液的体积（mL）；c——盐酸标准溶液的浓度（mol/L）；m——试样质量（g）。

1.2.5 数据分析和模型建立 采用Office Excel软件对电子鼻检测数据进行均值、方差和计算；使用电子鼻自带的Multivariate Statistics软件（AlphaSoft software）对数据进行主成分分析（PCA），检测分析同一检测任务条件下各传感器真利润的信号“表征特征”。数据经过筛选后，采用SAS V8.1 软件（SAS Institute，Cary，NC，USA）进行多元回归分析，并建立数学模型。

2 结果与分析

2.1 贮藏时间对牦牛肉挥发性成分的影响

对4，25和37℃条件下牦牛肉挥发性成分随贮藏时间的变化进行分析。由图1可见，除LY2/g CT外，其他17种传感器对牦牛肉挥发性成分的响应值均较高，说明鲜牦牛肉挥发性成分较为丰富。随着贮藏时间的延长，牦牛肉脂肪氧化加重，同时微生物逐渐繁殖，分解、代谢产物增多，因此挥发性成分亦增多[23]。检测数据与之符合，随着贮藏时间的延长，3种温度下电子鼻各传感器的响应值均有增加的趋势。但4℃下120，144 h和37℃下48 h时的挥发性成分却稍有下降，这可能是由于，随着贮藏进入后期，脂肪氧化和微生物的繁殖都进入一个“平台期”，挥发性成分增加有限，而随着持续挥发和消耗，总量有所减少。

经进一步的分析可知，虽然各传感器的响应值随贮藏时间的延长而增加，但不同传感器对牛肉挥发性成分的识别度不同，因此其增加幅度也不同。以4℃贮藏温度下的电子鼻检测数据为例，LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL和LY2/gCT等6种传感器响应值可增加5～15倍，T30/1、T70/2、PA/2、P30/1、P40/2、P30/2和T40/2 等 7 种传感器响应值增加约2倍左右，而P10/1、P10/2、P40/1、T40/1、TA/2等 5种传感器响应值仅增加15%～40%。已知LY2/AA传感器对乙醇、丙烷等物质灵敏，PA/2传感器对氨水和胺类化合物较灵敏[24]，由此可见，本试验将更加关注LY2/AA和PA/2传感器识别度，其信号作为判别肉的新鲜度的重要参考。由图1数据可知，随着贮藏时间的延长，上述2种传感器在牦牛肉贮藏过程中，变化的确较大，具有较好的识别度，也直接反映了牦牛肉中醇类和胺类化合物增加幅度较大。

肉的腐败主要是由脂肪等成分氧化和微生物繁殖导致[25]。在这一过程中，蛋白质逐渐分解为多肽和氨基酸，氨基酸进一步分解可产生硫化氢、氨、酚类和胺类物质[26]；脂类可被分解为游离脂肪酸和神经碱等，或被氧化为低分子内酯类、醇类、醛类、酮类及羧酸类物质[27]。这些小分子分解或氧化产物均具有一定的挥发性。因此，随着贮藏时间的延长，其挥发性成分逐渐增多，电子鼻气味传感器的响应值也逐渐增大。

2.2 贮藏温度对牦牛肉气味指纹的影响

为了考察不同贮藏温度对牦牛肉气味指纹的影响，选取了3中贮藏温度下0，24和48 h时牦牛肉的电子鼻检测数据进行分析。由图2可知，贮藏开始时，3种温度下牦牛肉电子鼻检测数据的雷达图基本重叠，挥发性成分总体较为一致。贮藏24 h后，挥发性成分的总体轮廓扩大，特别是37℃下样品的一些传感器响应值已达到或接近其上限，与25℃和4℃条件下的样品产生了较大的差异，由此可见，在较高温度下牦牛肉产生了更多的挥发性成分。随着贮藏时间的继续延长，在48 h时，3种温度下牦牛肉挥发性成分的总体轮廓进一步扩大，25℃和4℃下的样品亦产生了较大差异。此结果亦表明各传感器对贮藏过程中牦牛肉挥发性成分识别度差异，对于可以反映牛肉腐败的LY2/AA和PA/2传感器来说，由图2判断PA/2传感器对分析牦牛肉新鲜度效果更好。

温度越高，脂肪氧化等各种化学反应和微生物繁殖速度越快，因此各种氧化产物和微生物分解产物也越多[28]。牦牛肉各种营养成分丰富，水分活度高，在37℃条件下，是微生物的天然培养基，在贮藏24 h后，微生物特别是霉菌大量繁殖，产生丰富的挥发性成分，因此电子鼻各传感器的响应值大大增加。由于不同温度条件下微生物生长速度存在差异，当贮藏48 h时，不同温度条件下样品的总体风味轮廓显现出显著的差异。

图1 牦牛肉挥发性成分随贮藏时间的变化Fig.1 Volatile composition of yak meat changes with storage time

2.3 牦牛肉电子鼻检测数据的主成分分析（PCA）

由以上分析可知，随着贮藏时间的延长和贮藏温度的升高，牦牛肉挥发性成分均表现出增加的趋势。为了总体考察不同贮藏时间和不同温度下所有样品的挥发性成分变化规律，对所有样品的电子鼻检测数据进行了主成分分析（PCA）。

图2 贮藏温度对牦牛肉挥发性成分的影响Fig.2 The influence of storage temperature on volatile composition of yak meat

主成分分析是一种分析数据的统计学方法，其目的是在多维数据空间中，寻找到一组合适的特征向量，将原有的高维数据投影为较低维的数据空间，并在此过程中保留数据的主要信息，以便在所有的特征中提取主要特征[29-30]。在本试验中，通过主成分分析，可以将所有18种传感器检测数据的主要特征提取出来，在保留数据信息的前提下简化数据，从而使样品间的数据分析变得简便和直观。

使用电子鼻自带的数据处理软件对17个牦牛肉样品的监测数据进行主成分分析，结果如图3所示。由图可见，样品的数据点分布具有一定的规律，“4-0”、“4-24”、“4-48”、“25-0”、“25-12”、“25-24”、“37-0”和“37-12”等处于贮藏前期的样品均分布于右侧，其他贮藏后期的样品分布于左侧。牦牛肉样品电子鼻的检测数据主成分1（PC1）贡献率为 84.465%，主成分 2（PC2）贡献率为10.384%，表明主成分可以大致反映样品信息，样品之间具有有效的区分。

随着贮藏的进行，牦牛肉新鲜度逐渐下降，而从PCA结果表明，电子鼻检测数据与牦牛肉的新鲜度具有一定的相关性。为了验证这一推断，后面试验进一步讨论、分析牦牛肉气味指纹特征与其新鲜度之间的关系，对电子鼻检测数据与牦牛肉感官评价结果及挥发性盐基氮测定值之间的相关性进行了研究。

图3 牦牛肉挥发性物质的PCA图Fig.3 PCA diagram of the volatile substances of yak meat

2.4 牦牛肉的感官评价结果

对不同贮藏条件下的17组牦牛肉样品进行感官评价，从色泽、黏度、弹性、和气味4个主要方面进行考察，根据表1的感官评定标准对所有取样的牦牛肉进行评判，结果见表2。随贮藏时间的延长，牦牛肉样品的色泽、黏度、弹性和气味的感官评级均逐渐下降。4℃下样品的感官指标下降较慢，贮藏96 h时由“新鲜”降为“次鲜”，而25℃和37℃样品下降较快，分别在36 h和24 h时将为“次鲜”。

根据感官评价，样品“4-0”、“4-24”、“4-48”、“4-72”“25-0”、“25-12”、“25-24”、“37-0”和“37-12”为“新鲜”，样品“4-96”、“4-120”、“25-48”和“37-24”为“次鲜”，样品“4-144”、“25-48”、“37-36”和“37-48”被判定为“变质”。由 2.1 节中 LY2/AA和PA/2传感器对牦牛肉贮藏过程中与腐败直接关系的醇类和胺类化合物较为敏感，作为牦牛肉新鲜程度的表征特征。结合线性相关性分析，结果表明感官评定结果与样品电子鼻检测数据的PCA结果确实存在一定的相关性，图3中PC1大于0的样品可判定为“新鲜”，而PC1小于0的样品多被判定为“次鲜”和“变质”，表明牦牛肉电子鼻检测数据确可作为其新鲜度的评价依据。

虽然对牦牛肉新鲜度的感官评价结果接近一般消费者的判断标准，但感官评价易受评价者个人主观性和偏好性的影响，因此，需要进一步以较为客观的理化指标为标准，对牦牛肉电子鼻检测数据与其新鲜度的相关性进行研究。

表2 牦牛肉感官评定结果Table 2 The sensory evaluation results of yak meat

2.5 贮藏过程中牦牛肉TVBN值测定结果

挥发性盐基氮是能够比较准确反映鲜肉制品新鲜程度的指标。不同贮藏温度下，牦牛肉样品的TVBN值随贮藏时间的变化见图4。随着贮藏时间的延长，牦牛肉的TVBN值逐渐增加，且增加速度有逐渐加快的趋势，表明在贮藏后期牦牛肉新鲜度急剧下降。

对比感官评定结果和TVBN测定结果，两者具有较好的一致性：TVBN值小于10 mg/100 g时，感官评定结果多为 “新鲜”；TVBN值大于10 mg/100 g而小于15 mg/100 g时，感官评定结果多为“次鲜”；“变质”肉的TVBN值则大于18 mg/100 g。

图4 牦牛肉贮藏过程中挥发性盐基氮（TVBN）测定结果Fig.4 Results of volatile basic nitrogen（TVBN）of yak meat during storage

2.6 电子鼻检测数据与牦牛肉TVBN值的相关性分析

由上分析可知，TVBN值能够客观、准确地反映牦牛肉的新鲜程度。为了探讨牦牛肉挥发行成分与其新鲜度之间的关系，以TVBN值为依据，对电子鼻检测数据与牦牛肉TVBN值的相关性分析进行了详细的分析。

2.6.1 电子鼻检测数据的筛选 由2.1节分析可知，样品“4-120”、“4-144”和“37-48”由于贮藏时间过久，挥发性成分有所下降，而样品“37-24”和“37-36”部分传感器的响应值出现过载现象，因此，以上样品的检测数据予以剔除。

某些挥发性成分波动大或传感器对其响应不够稳定，使一些检测数据标准方差较大，其中“LY2/LG”、“LY2/G”、“LY2/AA”、“LY2/GH”、“LY2/gCTL”、“LY2/gCT”、“T70/2”和“P30/2”传感器的响应值均出现相对标准方差（RSD）大于10%，加之这些传感器所检测的信号变化，对牦牛肉贮藏过程中与腐败相关的主成分变化匹配度低（结合感官评定），因此剔除上述传感器的数据。

按照上述条件对电子鼻检测数据进行筛选，将筛选后的数据（表3）用于后续的相关性分析。

表3 经过筛选后的电子鼻检测数据Table 3 The electronic nose data have been screened

2.6.2 传感器响应值与TVBN值的相关性 经过筛选后，对10种传感器的响应值与TVBN值的相关性进行计算。结果显示，10种传感器与TVBN值均具有较好的相关性（图5），相关系数均大于0.800（表4），最高可达0.953，这些优选的传感器响应值可以作为牦牛肉新鲜度评价的依据[31]。

尽管这种相关性仅能体现单个传感器与TVBN值之间的关系，为了整体评价所有10种传感器响应值与牦牛肉TVBN值的相关性，仍需对数据进行深入分析。

图5 传感器响应值与TVBN之间的相关性Fig.5 Relationship between sensor response value and TVBN

表4 传感器响应值与TVBN的相关系数（R）Table 4 The correlation coefficient（R）of sensor response value and TVBN

2.6.3 多元线性回归分析建立数学模型 多元线性回归广泛应用于一个随机变量与多个变量之间相关关系的分析。在现实问题研究中，某一问题（因变量）往往受到不止一个因素（自变量）的影响，因此需要使用多个因素作为自变量来解释因变量的变化[32]。当多个自变量与因变量之间为线性关系时，所进行的回归分析即为多元线性回归。在多元性回归模型中，参数估计是在误差平方和为最小的前提下，采用最小二乘法求得[33]。

在本试验中，假设TVBN值为因变量（y），10种传感器的响应值为自变量（x），即可通过多元线性回归建立传感器的响应值与TVBN值之间的线性关系。一阶多元线性回归的数学模型为：

y=β0+β1x1+β2x2+β3x3+β4x4+β5x5+β6x6+β7x7+β8x8+β9x9+β10x10+ε

其中，β0为常数项，其中x1-x10分别为10种传感器的响应值，y为TVBN值，ε为随机误差，表示其他随机因素引起的y值变化。采用零均值假设，通过SAS软件计算，得回归模型的决定系数（RSquare）为 0.9983，调整决定系数（Adj R-Sq）为0.9812，剩余标准差（Root MSE）为 0.18561。各因素回归系数计算结果如见表5。

表5 多元线性回归系数与检验Table 5 Multiple linear regression coefficients and test

于是方程为：

y=-130.7－16.8 x1－119.6 x2+975.9 x3+15.8 x4－114.0 x5+66.6 x6+3.2 x7+28.2 x8－219.3 x9－333.1 x10

根据此方程计算TVBN的预测值，与实际检测值进行比较，结果见表6，各样品预测值与检测值之间的残差均较小，且在“0”值附近呈随机分布，表明该模型对TVBN值的预测具有较高的准确性。

表6 回归模型的检验Table 6 The assessment of regression model

3 小结

贮藏时间和贮藏温度对牦牛肉挥发性成分均有较大的影响。随着贮藏时间的延长，各传感器的响应值均表现为增加的趋势。不同传感器的增加幅度不同，其中LY型传感器的响应值可增加5～15倍，T30/1等7种传感器响应值增加约2倍左右，而P10/1等5种传感器响应值仅增加15%～40%，这表明随着贮藏时间的延长，牦牛肉中醇类和胺类化合物增加幅度较大。在相同贮藏时间下，温度越高各传感器的响应值越大，表明高温有利于反应和微生物的繁殖，从而产生更多的挥发性物质。

主成分分析结果表明，处于贮藏前期的样品与贮藏后期样品具有不同的分布区域，各样品之间能够有效区分。牦牛肉样品感官评价结果与主成分分析结果具有较好的一致性，主成分分析分布于右侧的样品多被判定为“新鲜”，而分布于左侧的样品多被判定为“次鲜”和“变质”。

当TVBN值为10 mg/100 g时，感官评定结果多为“新鲜”向“次鲜”转变，“变质”肉的 TVBN值则大于18 mg/100 g。各传感器响应值与TVBN之间均具有较高的相关性，相关系数均大于80.0%，最高可达95.3%。通过多元线性回归对数据进行分析，建立了10种传感器响应值与TVBN值之间的数学模型，该模型相关系数达到决定系数可达到0.9983，调整决定系数为0.9812，剩余标准差为0.18561，表明该模型具有较高的可靠性，可用于牦牛肉新鲜度的预测。