PALLD基因rs1071738位点单核苷酸多态性与乳腺癌的相关性研究

李倩 黄国强*

乳腺癌是女性常见的癌症之一，在我国女性中乳腺癌的发病率逐年升高，研究显示每年我国女性新发乳腺癌患者达27万左右［1］，其中约有3%～8%左右的乳腺癌患者初诊时已经转移［2］，严重威胁女性生命健康和生活质量。microRNAs（miRNAs）是一种负调控基因表达的非编码小RNA，与肿瘤发生、侵袭和转移密切相关［3］。最近研究表明，miRNA结合位点中的单核苷酸多态影响miRNAs的调控作用，影响相关基因的表达水平，增加疾病的风险［4］。生物信息学分析发现PALLD基因rs1071738位点单核苷酸多态性可能与乳腺癌的转移相关，rs1071738位点位于PALLD基因的3'-UTR处，该位置是miR-96和miR-182的靶点位置。本文探讨血浆miR-96和miR-182水平及PALLD基因rs1071738位点SNP与乳腺癌发生风险以及进展的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年10月至2017年12月本院收治的乳腺癌患者150例为观察组，乳腺癌的诊断是2位病理医师根据世界卫生组织（WHO）《乳腺病理组织学分类》（2012年版）［5］标准读片确认其病理类型，其中浸润性导管癌100例，浸润性小叶癌45例，其它类型癌5例；年龄38～58岁，平均年龄（48.50±8.52）岁。身体质量指数（BMI）为（24.15±3.52）kg/m2；雌激素受体（ER）阳性45例，孕激素受体（PR）阳性39例；TNM分期Ⅰ期52例，Ⅱ期32例，Ⅲ期37例，Ⅳ期29例。同期根据观察组患者的年龄配对选择体检健康的妇女150例为对照组，年龄40～63岁，平 均（48.72±10.15） 岁，BMI（24.22±3.75）kg/m2。排除有其它部位肿瘤的患者、免疫系统疾病的患者。两组年龄、BMI等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 PALLD基因分型检测 取血浆约5ml，EDTA抗凝后血浆用于RNA抽提，血细胞用于基因组DNA提 取。 使 用 QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN，Gaithersburg，MD）试剂盒提取基因组DNA，设计PALLD基因rs1071738位点PCR扩增引物后由金唯智生物科技有限公司合成，其中上游引物序列为5'-AAC CGA GCA GGA CAG AAC-3'；下游引物序列为5'-TGG TGG CAC TCC CAA TAC-3'。以提取的基因组DNA为模板，使用PCR扩增试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）进行PCR扩增，扩增产物由金唯智生物科技有限公司进行测序，根据测序结果分析PALLD基因rs1071738位点基因型。

1.3 miR-96和miR-182测定方法 取分离的血浆，使用Trizol（Invitrogen）抽提总RNA，用miRNease Mini kit（QIAGEN，Gaithersburg，MD）进行分离。为了去除任何对基因组或质粒DNA的污染，使用RQ1 RNase-free DNase（Promega，Madison，WI）进行处理。用实时定量RT-PCR检测处理后的RNA样品中miR-96和miR-182的表达量，使用的试剂盒是 TaqMan miRNA assay（Applied Biosystems，Foster City，CA），内参为RNU6B，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件。计量资料以（s），采用单因素方差分析或t检验；计数资料以［n（%）］表示，用χ2检验。使用χ2检验分析基因型频率是否符合Hardy-Weinberg平衡。使用非条件Logistic回归分析计算比值比（OR）和95%置信区间（CI），分析不同基因型与乳腺癌发生风险之间的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PALLD基因rs1071738位点基因型和等位基因频率 PALLD基因rs1071738位点基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。观察组患者与对照组PALLD基因rs1071738位点基因型频率之间的差异有统计学意义（χ2=31.589，P＜0.001），以野生型（GG）作为参考，杂合子（GC）和纯合子（CC）均是乳腺癌的保护因素（OR=0.140，95%CI：0.058～0.329，P＜0.001；OR=0.240，95%CI：0.050～0.098，P=0.024）。观察组患者C等位基因频率显著低于对照组，差异有统计学意义（χ2=31.582，P＜0.001），以G等位基因为参考，C等位基因是乳腺癌的保护因素（OR=0.200，95%CI：0.104～0.379，P＜0.001），见表 1。

表1 PALLD基因rs1071738位点单核苷酸多态性与乳腺癌风险［n（%）］

2.2 PALLD基因rs1071738位点单核苷酸多态性与乳腺癌分期的相关性 合并TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期以及Ⅲ与Ⅳ期，分析PALLD基因rs1071738位点单核苷酸多态性与不同TNM分期的相关性，结果显示不同基因型患者TNM分期的差异有统计学意义（χ2=5.871，P=0.015），以野生型为参考，突变型乳腺癌患者进 展 期 的 较 少（OR=0.114，95%CI：0.005～0.904，P=0.015），见表 2。

表2 PALLD基因rs1071738位点基因多态性与乳腺癌患者TNM分期相关性

2.3 血浆miR-96和miR-182水平 采用RT-PCR检测所有受试者血浆miR-96和miR-182水平，结果显示乳腺癌患者血浆中miR-96和miR-182水平显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.001），见图1。

图1 血浆miR-96和miR-182水平比较

2.4 血浆miR-96和miR-182水平与乳腺癌分期的相关性 分析乳腺癌患者不同TNM分期与血浆miR-96和miR-182水平之间的相关性，结果显示Ⅰ、Ⅱ期患者血浆miR-96和miR-182水平显著高于Ⅲ、Ⅳ期患者，差异均有统计学意义（P＜0.001），见图2。

图2 不同TNM分期的乳腺癌患者血浆miR-96和miR-182水平

2.5 PALLD基因rs1071738位点单核苷酸多态性与血浆miR-96和miR-182水平的关系 分析PALLD基因rs1071738位点不同基因型受试者血浆miR-96和miR-182水平，结果显示，野生型受试者血浆miR-96和miR-182水平显著低于突变型受试者，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3A。分析乳腺癌患者血浆miR-96和miR-182水平与PALLD基因rs1071738位点单核苷酸多态性之间的相关性，结果显示野生型乳腺癌患者血浆miR-96和miR-182水平显著低于突变型乳腺癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3B。

图3 PALLD基因rs1071738位点基因多态性与血浆miR-96和miR-182水平相关性。A图为所有受试者血浆miR-96和miR-182水平，B为乳腺癌患者中血浆miR-96和miR-182水平。

3 讨论

乳腺癌早期诊断和检测是其筛查的主要方式。目前的常规筛选试验由于假阳性结果而具有危险性或不可靠性，因此需要鉴定用于乳腺癌的可靠和早期检测的新型非侵入性或微创生物标志物。基于体液的microRNA为早期检测乳腺癌提供极好的非侵入性诊断工具［6-9］。近年来，microRNA的表达改变被认为是包括乳腺癌在内的各种癌症中最可靠的诊断生物标志物［10］。

PALLD基因起始位点和选择性剪接导致该基因编码多个亚基，其亚基参与细胞的迁移，尤其是乳腺癌细胞的迁移［11］。通过细胞外基质降解与细胞骨架［11］的连接、调节胞浆体和胞壁凸出形成［12-13］等多种机制，促进细胞的侵袭和运动。PALLD基因表达的Palladin蛋白与miR-96和miR-182表达呈显著的负相关关系，Palladin表达与浸润性乳腺癌细胞淋巴结转移呈正相关［14］。本资料结果显示，在乳腺癌患者血浆中的miR-96和miR-182水平显著低于健康对照组，笔者认为乳腺癌患者血浆中miR-96和miR-182水平低，Palladin蛋白水平较高，而高水平的Palladin蛋白参与对于细胞的迁移和侵袭活动具有促进作用。本资料中Ⅲ期和Ⅳ期乳腺癌患者血浆中miR-96和miR-182水平低，同理Palladin蛋白水平较高，细胞的迁移和侵袭活动较强。

本资料结果显示，携带突变型C等位基因的群体患乳腺癌的风险低于野生型等位基因（G）携带者，且突变型乳腺癌患者进展的风险较低。野生型患者血浆miR-96和miR-182水平显著低于突变型，作者推测C等位基因与miR-96和miR-182能够更好的结合，使miR-96和miR-182能够更好的发挥调控作用，显著降低Palladin蛋白的表达，降低乳腺癌的发生率和乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。然而，有研究者认为miR-96在乳腺癌中具有促癌作用，如有研究者发现miR-96可能通过调节ABCA1抑制细胞凋亡，从而在乳腺癌中发挥致癌作用［15］。Hong等［16］研究认为miR-96可通过沉默PTPN9促进乳腺肿瘤发生，对于不同研究结果作者认为miR-96在机体内的靶点并不唯一，通过不同靶点作用可能产生不同的调控结果。

综上所述，PALLD基因rs1071738位点单核苷酸多态性与乳腺癌的发生风险和进展相关，可能机制是PALLD基因rs1071738位点单核苷酸多态性影响miR-96和miR-182的调控作用。