人子宫内膜干细胞移植对FSGS大鼠肾组织中TNF-α和IL-6表达水平的影响

唐玥雯 杨汝春* 万凤 张华琴 王军 林宜

局灶节段性肾小球硬化（Focal and segmental glomerulosclerosis，FSGS）是一类常见的原发性肾小球疾病，其治疗困难且预后较差，是导致终末期肾功能衰竭（End-stage renal disease，ESRD）的主要原因之一［1-2］。前期研究发现骨髓间充质干细胞可通过抑制肾脏炎症因子的表达来缓解肾脏局灶节段性肾小球硬化［3］。而子宫内膜干细胞（MenSC）是一群来源广泛，具有自我更新、多向分化和高度增殖潜能的干细胞，有望成为良好的移植细胞源［4］。2017年1月至2019年3月作者通过实验研究，探讨MenSC移植对缓解FSGS大鼠进程的影响，及其对肾组织炎症因子TNF-α和IL-6表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 阿霉素（浙江海正药业股份有限公司，批号：040505）；氯胺酮（福建古田药业有限公司）；DMEM培养基（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；兔抗大鼠TNF-α抗体和兔抗大鼠IL-6抗体，购于武汉博士德生物工程有限公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA、山羊血清、羊抗兔HRP二抗、DAB显色液及抗原修复液（上海迈新生物技术有限公司）；SYBR® Premix Ex TaqTM、ROX Reference Dye（50×）、引物设计及合成等均自TaKaRa公司。日立7180型全自动生化分析仪（日本株式会社日本高新技术）；Real-time PCR仪（ABI 7500）；低温低速离心机（Heraeus，LEGENTRT，德国）；制冰机（Scotsman，AF100，意大利）。

1.2 实验动物与细胞 大鼠选用3周龄雌性，体重160～180g，清洁级SD大鼠，大鼠购自浙江中医药大学实验动物中心。动物质量合格证号为SCXK（沪）2007-0005。饲养条件：恒温，温度20±1℃，湿度50%～60%，光照每12h明暗交替，通风8～15次/h。实验饲养室许可证号：SYXK（浙）2003-0003。MenSC购于杭州易文赛生物技术有限公司子宫内膜干细胞库，是从健康成年女性月经血中分离得到的一种新来源的间充质干细胞。

1.3 方法 （1）细胞培养：用含15%胎牛血清的DMEM培养基培养MenSC细胞，置于含5% CO2的37℃培养箱中进行孵育。当细胞生长至80%～90%融合时，采用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，按1∶3的比例进行传代。（2）FSGS大鼠模型建立：将健康雌性SD大鼠称重后随机分为正常组、模型组和移植组，每组各6只。模型组及移植组大鼠先采用50mg/kg氯胺酮腹腔注射，待其麻醉后行左肾摘除术，术后第7、28天分别尾静脉注射5mg/kg和2mg/kg阿霉素。正常组大鼠麻醉后行假手术，术后同时间内以等量生理盐水进行尾静脉注射。（3）细胞移植：用胰酶消化生长状态良好的P3～P5代MenSC，用PBS重悬后调整细胞密度至1×107/ml。移植组于术后第28天尾静脉注射MenSC细胞悬液1ml；正常对照组大鼠不作任何处理，模型组大鼠注射等量PBS作为对照。（4）血液和尿液标本的收集及测定：实验结束前，使用代谢笼法收集24h尿量，量取尿量，用生化仪常规测定尿蛋白，结合尿量计算24h尿蛋白；在术后8周末氯胺酮麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心后收集上层血清，生化仪测定血肌酐、尿素氮、血浆白蛋白等指标。（5）Real-time：PCR扩增：Trizol提取大鼠肾脏总RNA，取约2μg总RNA逆转录成cDNA，并进行real-time荧光定量PCR，采用GAPDH作为内参。TNF-α上游引物序列5'-GGCGTGTTCATCCGTTCT-3'，下游引物序列5'-CCACTACTTCAGCGTCTCG-3'，PCR扩增片段201bp；IL-6上游引物序列5'-CCTTCTTGGGACTGATGT-3'， 下 游 引 物序 列 5'-TCCAGGTAGAAACGGAAC-3'，PCR扩增片段267bp；GAPDH上游引物序列5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物序列5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，PCR 扩 增 片 段453bp。PCR反应体系为：SYBR Premix Ex Taq（2×）10μl，上下游引物各 0.4μl，ROX Reference Dye（50×）0.4μl，DNA 模 板 2.0μl，ddH2O 6.8μl。 于 ABI PRISM 7500荧光定量PCR扩增仪上进行反应，扩增条件为：95℃预变性30s，继以95℃ 5s，60℃ 31s共40个循环，数据以2-△△Ct表示。（6）免疫组化检测肾组织中TNF-α和IL-6表达：处死大鼠后，取出部分肾组织，经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋后制成3μm厚的石蜡切片。免疫组化检测肾组织中TNF-α和IL-6表达的步骤如下：切片脱蜡、水化、抗原修复、PBS洗涤、胰蛋白酶消化、PBS清洗，5%山羊血清封闭30min后加入兔抗大鼠一抗（TNF-α 1∶50；IL-61∶100），置于4℃冰箱中过夜；PBS洗涤后加增强剂，37℃放置30min，然后滴加羊抗兔HRP二抗，37℃放置45min；清水冲洗3次后DAB显色至棕黄色阳性信号出现，清水阻断，洗3～4次后苏木素复染，脱水晾干封片。采用ImagePro plus6.0图像采集及分析系统，每张切片（×400）光镜下随机采集5个不重叠视野，测量棕黄色阳性染色平均积分光密度（Integral Optical Density，IOD），取平均值作为每例切片的平均IOD。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料用（s）表示，方差齐者，多组间采用one-way ANOVA检验，组间两两比较用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MenSC移植对FSGS大鼠24h尿蛋白的影响 见表1。

表1 MenSC移植对FSGS大鼠24h尿蛋白水平的影响（s）

表1 MenSC移植对FSGS大鼠24h尿蛋白水平的影响（s）

注：与模型组比较，* P＜0.05，** P＜0.01

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2.2 MenSC移植对FSGS大鼠血肌酐、尿素氮和白蛋白的影响 见表2。

表2 MenSC移植对FSGS大鼠血肌酐、尿素氮和白蛋白的影响（s）

表2 MenSC移植对FSGS大鼠血肌酐、尿素氮和白蛋白的影响（s）

注：与模型组比较，* P＜0.05，** P＜0.01

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2.3 MenSC移植对FSGS大鼠TNF-α和IL-6转录水平表达的影响 见图1。

图1 RT-PCR法检测大鼠肾组织TNF-α和IL-6的基因表达（n=6）

2.4 MenSC移植对FSGS大鼠TNF-α和IL-6蛋白水平表达的影响 见图2、表3。

图2 免疫组化染色检测各组大鼠肾组织TNF-α 和IL-6的表达（IHC，×400）

表3 半定量分析免疫组化中肾组织TNF-α和IL-6表达（s）

表3 半定量分析免疫组化中肾组织TNF-α和IL-6表达（s）

注：与模型组比较，* P＜0.05，** P＜0.01

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3 讨论

FSGS是由多病因导致的、以肾小球节段硬化为病理特征的一种疾病，是一种常见的、极易进展为ESRD的肾小球疾病［5-6］。然而，目前对FSGS的治疗主要依赖于激素和免疫抑制剂，这些只能从某种程度上延缓其发展。因此，亟待寻找一种安全、有效，能从根本上控制甚至逆转FSGS 病程进展的方法。

干细胞自我更新和分化为各种细胞的潜能及免疫调节作用，为FSGS的治疗开辟新的希望。已有研究证明人脐带血来源干细胞移植可缓解FSGS大鼠肾小球硬化的进展，降低血清中IL-6和TNF-α的表达［7］。MenSC是一类存在于子宫内膜基底层的成体干细胞，不仅易于获取，且具有一般成体干细胞的自我更新、无限增殖和多向分化的潜能［8-9］。此外，其还具有较低的免疫源性，在临床上有着广泛的应用前景。但有关MenSC用于FSGS治疗的研究少有报道。本资料结果显示，结果显示MenSC移植组后6+周24h尿蛋白、血肌酐及尿素氮较模型组均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），提示MenSC可在一定程度上缓解FSGS的进程。

多种慢性肾脏病的发生发展均与炎症存在相关性，FSGS的发生也通常伴随着炎症的存在［10-12］。本资料测定了肾组织中炎症关键因子TNF-α和IL-6的表达。TNF-α主要由巨噬细胞分泌，是细胞因子的关键成分，可引起免疫细胞的激活，诱导其它细胞因子的产生［13］。有研究表明TNF-α在阿霉素肾病大鼠模型形成中起重要作用［14］。IL-6是一种多功能细胞因子，是调节细胞因子网络中的关键成分。研究显示IL-6参与多种慢性肾脏病的发生和发展［15］。其既可由淋巴细胞（T细胞和B细胞等）分泌，也可由非淋巴细胞（成纤维细胞和巨噬细胞等）分泌［16］。在本实验中，RT-PCR结合免疫组化结果显示FSGS大鼠中TNF-α和IL-6的基因表达和蛋白表达均较正常组明显增高（P＜0.01），表明FSGS大鼠体内存在炎症反应。然而，MenSC移植后TNF-α和IL-6的表达均具有一定程度的下调（P＜0.01或P＜0.05），提示MenSC可阻断炎症细胞等对TNF-α和IL-6的分泌，进一步减少由TNF-α和IL-6刺激产生的炎症因子的生成，从而改善FSGS大鼠肾功能。

综上所述，MenSC移植可缓解FSGS的进程，其作用机制可能是通过抑制肾组织中炎症细胞因子TNF-α和IL-6的表达。由于FSGS涉及到多种炎症因子及细胞因子，致病机制复杂，有待于进一步的深入研究。