基于间充质干细胞的抗菌治疗及展望

朱冬振 李美蓉 姜玉峰 付小兵

（1.解放军总医院基础医学所创伤愈合和细胞生物实验室，北京 100853；2.战略支援部队特色医学中心创面治疗中心，北京 100101）

间充质干细胞（MSCs）是一种自我更新的多能细胞，具有巨大的再生医学和组织工程应用潜能。MSCs分布于骨髓及其他器官间质内，包括脂肪组织，牙髓，产后组织如脐带、胎盘或经血[1-5]。间充质和组织干细胞委员会和国际细胞疗法学会（ISCT）对人MSCs定义的最低标准是：①黏附性；②表达特异性表面抗原，如表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b（均不表达或只表达其中之一）、CD79a或CD19（均不表达或吸表达其中之一）以及人类白细胞抗原-DR；③体外培养条件下，具有向骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的多向分化潜能[6]。MSCs还具有损伤组织的趋化性及低免疫原性，使其成为细胞治疗的有力工具[5]。目前，在由美国国立卫生研究院（NIH）临床试验网站ClinicalTrails.gov(https://www.clinicaltrials.gov/)上注册的基于MSCs的临床试验超过500项。

虽然，体内外实验阐明了MSCs的生物效应和再生特性，但是其具体机制仍然未知。目前普遍认为MSCs发挥作用的机制之一是通过旁分泌作用，比如通过释放生长因子、细胞因子和趋化因子等活性物质发挥其生物学效应[7]。研究显示，MSCs具有很强的抗菌效应[8-17]，包括间接抗菌作用和直接抗菌作用。其中间接抗菌作用主要是通过调节宿主对抗原的免疫应答，尤其是调节免疫系统促炎和抗炎效应的动态平衡[18]，以及增强吞噬细胞的活性来完成[10,13,16]；而直接抗菌作用主要是通过分泌抗菌肽（AMPs）[11-12,14,17]，以及表达吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）[8]和IL-17[19]来完成。同时，MSCs已经被证实在脓毒症[9-12,14,16]、急性呼吸窘迫综合征[13,17]和囊性纤维坏死感染[14]的前临床模型中，都具有很强的细菌清除能力。为此，我们将目前关于MSCs的直接抗菌作用，尤其是MSCs源性的AMPs作用的研究进展综述如下，阐述能够调节这些AMPs表达和分泌并且增强其抗菌效应的机制。

1 AMPs的抗菌机制

AMPs是进化保守的基因编码小效应分子，部分AMPs是机体构成性存在的，而另一部分则可能是由于感染或炎症诱发而产生。AMPs具有广泛的抗菌作用和免疫调节效应，可以选择性地对抗细菌、酵母菌、真菌、病毒，甚至是癌细胞[20]。AMPs通过不同的作用机制发挥清除微生物的作用，同时一些AMPs也受pH、AMPs自身浓度和盐浓度等多种因素的影响[20-21]。人类AMPs主要通过与细胞表面和细胞内的不同分子靶点相互作用来发挥效应。AMPs介导的杀菌机制通过破坏细胞膜的完整性，抑制蛋白质DNA和RNA的合成，以及和某些细胞内的靶点相互作用来发挥抗菌作用[20]。AMPs通常只对一类抗原发挥作用，比如细菌或真菌，也有一些AMPs可同时对几种微生物发挥作用[22]，还有一些特殊的AMPs可作用于对传统抗生素耐药的多重耐药菌，对其发挥杀伤作用。尽管在临床使用和商业化过程中，AMPs仍然有很多问题需要解决，如给药途径、潜在的毒性、稳定性和较高的生产成本，但这些问题也无法阻止AMPs成为药物开发的热点[23]。AMPs除了具有直接杀菌作用外，其间接生物学效应也有助于控制感染[24]。上皮细胞分泌的AMPs具有多种生物学特性，包括细胞因子和抗内毒素活性、抑制蛋白酶、细菌调理和促血管生成特性[24]。

目前研究表明，MSCs主要表达4种AMPs：LL-37[11,14]、人β-防御素-2(hBD-2)、铁调素(hepcidin)[12]和脂质运载蛋白-2(Lcn2)[17]，并且在感染及炎症状态下，这些AMPs可被进一步调节，以增强细菌清除率。MSCs发挥抗菌作用可能部分与这4种类型的AMPs有关。其中，LL-37对巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞具有趋化性[25]。LL-37也被证明具有中和脂多糖（LPS）的效应，在脓毒症小鼠模型中显示出抗感染性休克的作用[26]。β-防御素也有类似LL-37的作用，这可能由CC趋化因子受体6（CCR6）途径介导[27]。而铁调素和Lcn2[17]主要通过调节细菌生长所必需的铁的利用来发挥作用[17,28]。

2 MSCs抗菌效应的体外研究

MSCs抗菌特性的研究大多数来自于体外实验，且很少有关于MSCs对病毒、真菌和寄生虫作用的研究[29]。由AMPs介导的不同来源MSCs的抗菌效应、作用机制和抗菌范围已有所研究。MSCs可以针对特定类型抗原产生最有效AMPs的特异性应答，且小鼠和人MSCs的抗菌作用机制存在种属差异性。不同来源的MSCs中检测到和未检测到的AMP类型见表1。

表1 不同MSCs来源的AMP类型

目前，骨髓间充质干细胞(BMSCs)促进糖尿病创面愈合已得到大量实验的证明[30-31]，其抗菌特性的研究也最为广泛。人类BMSCs的抗菌效果是由LL-37[11,14]和铁调素[12]介导的。在受到刺激和未受到刺激的BMSCs中均能检测到AMPs。Krasnodembskaya等[10]的研究表明，BMSCs本身或其条件培养基均能够抑制细菌生长，但前提是BMSCs必须经过细菌预处理。另外，人防御素-2（hBD-2）、hBD-3、Lcn2和表面蛋白D(SPD)在BMSCs中不表达或者含量极低，不具备抗菌效果。近来，Sutton等[14]的研究表明，BMSCs主要分泌LL-37，在体外发挥很强的抗铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌作用，并控制细菌生长速率和转化成集落形成单位。这些数据表明，AMPs可能成为传统抗生素有效的辅助药物。并且，在受到炎症刺激如采用γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-1 β（IL-1 β）或IL-12预处理后，BMSCs分泌LL-37的水平升高[11-12]。相关的研究显示，受到刺激和未受到刺激的BMSCs均未检测到hBD-2和hBD-3的表达[14]。值得注意的是，BMSCs只有在胎牛血清培养基环境中才能检测到LL-37，而在无血清和血小板裂解产物培养条件下，BMSCs的抗菌效能和产生LL-37能力下降[14]。BMSCs发挥抗菌特性不仅局限在AMPs的活性方面，实际上，经过炎症因子刺激，BMSCs中IDO表达大量增加，并能够针对临床相关细菌、寄生虫和病毒发挥自主广谱的抗菌效果[8]。此外，研究显示，IL-17阳性小鼠BMSCs具有较强的抗真菌活性[19]。IL-17对白色念珠菌的抑制呈现剂量依赖性，而抗IL-17抗体能部分降低小鼠BMSCs抗白色念珠菌的能力[19]。小鼠BMSCs具有对大肠杆菌和白色念珠菌的抗菌效应潜能，但和人类BMSCs相比，其发挥抗菌效应的作用机制不同。Balan等[32]的研究结果显示，大肠杆菌预处理的小鼠BMSCs， Lcn2的产生显著增加，但并未检测到LL-37的分泌[17]。此外，与人的BMSCs相比，小鼠BMSCs即使在炎症因子如IFN-γ、IL-1β或IL-12的刺激下，也不能表达IDO，因此它们对细菌没有抑制作用[8]。但是也有报道显示，未受到刺激的小鼠BMSCs对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌有直接的吞噬作用，并且呈现剂量依赖性[16]，这一说法仍需进一步验证。

由于经血来源的间充质干细胞（MenSCs）可采用非侵入方式收集，并具有能够保证细胞数量及相同的遗传背景等优点，有望成为细胞治疗的另一种具有吸引力的细胞源[2]。MenSCs能够通过分泌铁调素发挥重要的抗菌作用。多种细菌均能够增加MenSCs中铁调素的表达，而其他AMPs，如LL-37和hBD-1-2-3仍然低于检测限[12]。在缺氧条件，铁调素下调会导致MenSCs的抗菌性能丧失，也表明了其铁调素依赖的抗菌机制[12]。从这个角度来看，缺氧对MenSEs功能的影响可以被认为是其抗菌活性的负调节剂，但缺氧本身又可以增强MenSEs的促血管生成作用[2]。因此，培养条件对于MenSCs的生物学效应非常重要。然而，缺氧对于MSCs的调节作用在很大程度上取决于MSCs的来源，比如有研究表明，低氧条件下，并不改变AT-MSCs的免疫抑制能力[33]。

Sung等[34]的研究显示，脐带间充质干细胞（UCMSCs）或细菌预处理后的UC-MSC来源条件培养基均能够显著抑制大肠杆菌的生长。基因表达谱分析显示，大肠杆菌刺激后，UC-MSCs中Toll样受体-2（TLR-2）和TLR-4以及hBD-2显著上调，提示MSCs可能通过TLR信号通路分泌hBD-2来发挥抗菌作用。特异性拮抗或沉默TLR-4后，反应性的hBD-2增高消失，MSCs的体外抗菌作用降低。额外补充hBD-2可恢复MSCs的体外抗菌作用，进一步提示MSCs的抗菌效果仅通过TLR-4途径分泌hBD-2介导。在该研究中，其他AMPs（如LL-37或Lcn2）的水平并未显著上调。

此外，AT-MSC或其条件培养基也显示出抗微生物作用。Sutton等[14]报道，AT-MSCs的条件培养基将铜绿假单胞菌生长速率降低的作用与遗传霉素（一种广谱氨基糖苷类抗生素）的作用相当。重要的是，AT-MSC结合遗传霉素显示出对铜绿假单胞菌的有效抗菌作用，揭示了这种类型的间充质干细胞具有增强抗生素效能的作用。

3 MSCs抗菌效应的体内研究

MSCs在体外的抗菌能力在体内也得到证实。不同来源MSCs能够减轻不同临床前模型中收集到的血液、脾脏、腹膜、肺和支气管肺泡灌洗液(BALF)中病原体的负载，并且与给药途径、剂量或注射时间无关[9-17]。

在大肠杆菌肺炎的免疫活性模型中，BMSCs处理后能够明显降低肺匀浆（LH）和BALF中的总细菌数量[11]。并且，BMSCs处理组中BALF细胞计数和绝对中性粒细胞计数也较低，表明BMSCs处理的小鼠不依赖于免疫细胞的募集来清除细菌。另外，中和LL-37抗体能够拮抗BMSCs的体内抗菌效果，这表明BMSCs的体内抗菌活性需要依赖LL-37发挥作用[11]，这些结果与Sung等[34]的研究结果一致。Sung等[34]的研究显示，同样在大肠杆菌肺炎的免疫活性模型中，注射UC-MSCs会引起炎症反应下调和细菌清除率增加，增加BALF中的hBD-2分泌，并增强由此产生的对大肠杆菌诱导的肺炎的保护作用。由于MSCs分泌的hBD-2是通过TLR-4途径介导，因此UC-MSCs的抗菌效果可被TLR-4 siRNA转染的UC-MSC所消除[34]。此外，另一类似临床前模型研究证明，小鼠BMSCs移植后，BALF中抗菌分子Lcn2的浓度增加，并且使用单克隆抗体阻断Lcn2会导致MSCs体内实验抗菌效果丧失[17]。

在盲肠结扎穿孔(CLP)诱导产生的多微生物败血症的免疫活性小鼠模型中，人或小鼠来源MSCs的移植显著减轻了病原体的负载，并显著改善了小鼠存活率[9,12,16,35]。另外，穿刺诱导的脓毒症模型中，移植MenSCs后，能够降低动物死亡率，同时能够改善器官功能障碍，调节炎症反应，促进血液中的细菌清除，这与抗生素治疗效果相当[12]。并且，MenSCs与抗生素联合能够起到协同作用，进一步提高生存率[12]。此外，Gonzalezrey等[9]研究显示，AT-MSC处理的脓毒症小鼠具有比未经AT-MSC处理小鼠更低的腹膜细菌计数，表明AT-MSC可通过自身或通过活化其他细胞来增强机体的抗菌性。

囊性纤维化病是一种遗传性疾病，其中肺部感染和炎症是造成其发病和死亡的主要原因。在囊性纤维化病的小鼠模型中，感染铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌后，进行BMSCs或其条件培养基移植，能够明显减少BALF中上述两种病原体的细菌菌落计数。目前，尚未见LL-37的体内抗菌效应的报道，但是体外的数据都显示它们具有在体内抑菌的潜能[14]。

4 前景和挑战

目前，除通过输注MSCs或者直接给予合成或天然AMP方式提高机体的抗菌性外，一些研究还希望通过膳食营养素和维生素调节体内内源性细胞的AMP表达，以促进先天免疫反应[36]。已有研究显示，维生素D3可直接调节人抗微生物肽LL-37和hBD-2的表达[37-38]。最近的一项研究显示，ICU中进行机械通气的患者中，使用高剂量维生素D3能够缩短住院时间，但血浆LL-37浓度或其他临床结局无明显变化[39]。维生素D具有刺激MSCs成骨的潜能[40]。这就需要体内外的实验进一步确定维生素D对MSCs的生物学效应。鉴于MSCs在机体中分布广泛，所以，刺激内源性MSCs中AMP分泌是提高机体自身抗菌效能的具有前景的策略。

随着耐药菌株的不断增加，临床迫切需要新的抗菌策略。发现新类别的抗菌药物或AMP非常具有应用前景，但这不是对抗耐药菌株的唯一策略。事实上，提高AMP的输送效率、生物利用度、体内释放和吸收，同时减少其清除和不良反应，都可以成为击败耐药菌株的助力器。而MSCs本身就可以显著改善AMP的药代动力学。它通过感应机体变化，发出释放AMP的信号，并能够趋化到损伤部位，在感染部位持续释放AMP，并且释放的AMP的种类与所受到的刺激相关。因此，专注于增强MSC的抗菌功能，可能更有利于其体内的抗菌效能。

5 结 论

MSCs通过间接和直接机制发挥强烈的抗微生物作用，部分机制是通过分泌AMP来实现的。在特定预处理后，可以进一步增强其在包括脓毒症[9-12,14,16]、急性呼吸窘迫综合征[13,17]和囊性纤维坏死感染[14]中的抗菌效应。这些证据都揭示了MSCs具有显著的抗菌效应，进一步增加MSCs中AMP的表达和分泌以增强其抗菌效能，是现实可行的抗菌策略。在不同的前临床模型中，MSCs预处理可提高MSCs源性AMPs的表达，从而增强细菌清除能力[9-14,16]。目前已知的预处理方式包括细胞因子、生长因子和UVB光刺激。随着研究的进展，应该会发现更为有效的预处理方式及更加有效的联合抗菌方案。