基于挥发性组分的气相色谱指纹图谱评价沉香化气片质量

青旺旺, 施宇涛, 杨 林, 张芮腾, 张景勍, 何 丹*

(1. 重庆医科大学药学院, 重庆 400016; 2. 重庆医药高等专科学校药学院, 重庆 401331)

沉香化气片收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第七册[1],全方由沉香、木香、广藿香、香附、砂仁、陈皮等10味药组成,具有理气疏肝、消积和胃的功效,用于治疗肝胃气滞、脘腹胀痛、胸膈痞满、不思饮食、嗳气泛酸。其中木香、广藿香、砂仁和陈皮4味药材蒸馏提取挥发油后入药。广藿香挥发油具有抗炎、抗菌、镇咳及调节胃肠道的功能[2,3],百秋李醇为广藿香的主要挥发性成分,也是广藿香质量评价的指标成分;砂仁挥发油具有明显的消炎镇痛、抗氧化、促进胃肠运动等多方面的功效[4],其主要成分为樟脑和乙酸龙脑酯;陈皮性温、味苦、辛,陈皮挥发油具有很好的促胃动力作用[5]。沉香化气片中的挥发性成分具有良好的药理作用,但目前沉香化气片现行质量标准仅有性状和显微鉴别项,而国内外关于沉香化气片含量测定的文献报道多见于采用高效液相色谱法测定橙皮苷的含量和气相色谱-质谱联用测定百秋李醇、樟脑、乙酸龙脑酯等成分的含量[6-9],同时也有采用超高效液相色谱法建立沉香化气丸的指纹图谱[10],但采用气相色谱法建立沉香化气片中挥发性成分的气相色谱指纹图谱的文献尚未见报道,难以全面体现其质量的优劣。因此,有必要建立沉香化气片的气相色谱指纹图谱。

中药复方制剂具有组成药材多、组成成分复杂的特点,中药指纹图谱能够充分提取中药制剂中的化学成分信息,具有整体性和全面性,通过指纹图谱方法能在一定程度上反映复方的内在质量[11-13],而化学模式识别既可以对指纹图谱的信息进行识别、处理,又可以将多个指标进行综合、降维和分类分析,从而更加客观、科学地反映中药制剂的质量信息,最终达到全面控制该制剂的整体质量的目的[14,15]。本实验拟建立沉香化气片的气相色谱指纹图谱,并结合相似度评价和化学模式识别,为该制剂的质量控制与评价提供科学的依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

气相色谱仪(GC-2010)、气相色谱-质谱联用仪(GCMS-TQ8040)配电子轰击(EI)源(日本岛津公司); 1/10万电子分析天平(SQP,赛多利斯科学仪器有限公司);超声波清洗器(KQ-2200B,昆山市超声仪器有限责任公司), Agilent DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱(美国Agilent公司)。

甲醇(色谱纯,美国天地有限公司),乙醇(分析纯,重庆川东化工集团有限公司), D-柠檬烯对照品(纯度>98%,批号Z28D8H51809,上海源叶生物科技有限公司),乙酸龙脑酯对照品和百秋李醇对照品(纯度均>98%,批号分别为MUST-18022605和MUST-17073111,成都曼斯特生物科技有限公司),正十八烷(纯度>99%,批号G9814,山东西亚化学股份有限公司), 20批沉香化气片(批号分别为18030026、18020015、18010007、18020013、18030029、18030024、18020012、18030019、18030023、17120095、18040031、18020016、18030022、18030027、17070058、18040033、18010006、18040030、18030021和17060049,依次记为S1～S20,太极集团)。

1.2 对照溶液的制备

内标溶液:精密称取正十八烷适量,加甲醇制得浓度为32.6 mg/L的正十八烷内标溶液。

对照品溶液:精密称取D-柠檬烯、乙酸龙脑酯、百秋李醇对照品适量,加甲醇分别制成质量浓度为61.54、37.5和53.3 mg/L的对照品溶液,即得。

1.3 供试品溶液的制备

取10片沉香化气片,研匀,精密称定0.5 g,置于具塞锥形瓶中,加入10 mL乙醇,称量,超声(频率40 Hz,功率100 W)处理30 min,放冷,再称定质量,用乙醇补足减少的重量,摇匀,静置,取上清液经滤纸滤过,将滤液过0.22 μm有机相微孔滤膜,取续滤液1 mL置于5 mL量瓶中,精密加入0.5 mL内标溶液,加乙醇至刻度,摇匀,即得。

1.4 色谱条件

1.4.1气相色谱条件

色谱柱:Agilent DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)柱;载气:氮气;进样口温度:250 ℃;进样模式:分流;分流比:5∶1。程序升温:初始温度为60 ℃,保持2 min,以2.5 ℃/min的速率升温至250 ℃,保持10 min。平衡时间:3 min; FID检测器温度:250 ℃;进样量:1 μL。

1.4.2质谱条件

离子源:EI源;离子源温度:200 ℃;接口温度:250 ℃;载气:氦气;溶剂延迟:2.5 min;扫描范围:m/z45～500。

2 结果与讨论

2.1 内标参照峰的选择

选择在气相色谱仪和气相色谱-质谱联用仪上检测性质稳定、定量准确、易于获得的烷烃。以正十八烷标准品溶液进样分析,所得谱图与样品谱图重叠比较,对共有峰无干扰,选择正十八烷为内标参照峰,如图1所示。

图 1 (a)正十八烷及(b)沉香化气片样品的色谱图Fig. 1 Chromatograms of (a) the n-octadecane and (b) the Chenxianghuaqi tablet sample Peak Nos. 1-11: components 1-11; T: n-octadecane.

2.2 样品提取方法的考察

样品以超声提取法、回流提取法、冷浸法进行提取,根据各成分的结构和性质,发现超声提取法和回流提取法均优于冷浸法,考虑到一些挥发性成分的热不稳定,且超声提取法简便快捷,故选择超声提取法。对提取溶剂(甲醇、乙醇、水、30%(体积分数,下同)甲醇、50%甲醇和80%甲醇)进行考察,结果表明乙醇对待测成分的提取优于甲醇,故选择乙醇为提取溶剂。对提取时间(30、45和60 min)进行了考察,结果表明提取时间≥45 min时,提取效果无明显差异,故选择提取时间为45 min。

2.3 含量测定

分别精密吸取适量对照品溶液和适量内标溶液,加甲醇稀释成6个不同水平浓度的对照品溶液,按1.4.1节方法进样测定,3个组分在各自的范围内线性关系良好,相关系数(r)均不小于0.999。以3个组分的峰面积RSD来评价定量分析的精密度、重复性和稳定性,RSD均小于3%,满足定量分析的要求。20批样品中,D-柠檬烯的含量为0.802～5.490 mg/g,乙酸龙脑酯的含量为0.074～0.218 mg/g,百秋李醇的含量为0.140～0.732 mg/g。各组分含量的差异可能是所用原药材的成分波动和生产过程的波动所导致的。

2.4 气相指纹图谱的分析

2.4.1方法学考察

在精密度试验中,精密吸取1 μL S1样品供试品溶液,按1.4.1节方法连续进样6次,记录气相色谱图。在稳定性试验中,分别在S1样品供试品溶液制备后0、2、4、8、12和24 h精密吸取1 μL,按1.4.1节方法进样测定,记录气相色谱图。在重复性试验中,取S1样品,按供试品溶液制备方法平行制备6份,分别精密吸取1 μL,按1.4.1节方法进样测定,记录气相色谱图。分别计算精密度试验、稳定性试验、重复性试验各共有峰相对于参照峰(内标峰)的相对保留时间和相对峰面积。

精密度试验、稳定性试验、重复性试验的各共有峰相对保留时间RSDs和相对峰面积的RSDs的结果分别为小于1%和小于3%、小于1%和小于3%、小于1%和小于4%。将精密度试验、稳定性试验、重复性试验的图谱分别采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行处理,精密度试验、稳定性试验、重复性试验分别6次进样的图谱与对照图谱相似度均不小于0.99,因此,表明仪器精密度良好,供试品溶液在24 h内稳定,该方法的重复性良好。

图 2 20批沉香化气片的气相色谱指纹图谱和对照指纹图谱Fig. 2 Gas chromatographic fingerprints of the 20 batches of Chenxianghuaqi tablets and the reference fingerprint (R) S1-S20: sample 1-20.

2.4.2气相色谱指纹图谱的建立

取20批沉香化气片样品,按供试品溶液制备方法制备溶液,按1.4.1节方法进样测定,记录气相色谱图。对所有色谱图进行统一积分后,将所得图谱以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件进行处理,对照图谱的生成方法为中位数法,时间窗宽度为0.1,运用多点校正方法对色谱图进行全峰匹配,生成对照指纹图谱(R)和20批样品的气相色谱指纹图谱图(见图2),确定了11个共有峰。

2.5 气相色谱-质谱联用对指纹图谱峰定性

应用气相色谱-质谱联用技术,对沉香化气片指纹图谱中的11个共有峰进行了初步定性,气相色谱-质谱条件见1.4节,沉香化气片样品的总离子流色谱图见图3,再利用计算机内解卷积软件[16,17]及匹配NIST14质谱库,最终经对照品比对、NIST14谱库检索和文献检索,对其中了10个成分进行了指认,对应气相色谱图中的8号峰未能指认,结果见表1。

2.6 指纹图谱的相似度评价

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件,将S1样品的色谱图作为参照图谱,计算20批沉香化气片指纹图谱的相似度。结果各共有峰保留时间的RSDs均<0.14%,各共有峰峰面积的RSDs相差较大,20批样品的相似度为0.952～0.999,相似度结果见表2。表明沉香化气片的化学组成成分相似,但各批次间共有峰成分含量差异较大,如需要更为客观地反映沉香化气片的内在质量,须进行化学模式识别。

图 3 沉香化气片样品的总离子流色谱图Fig. 3 Total ion current chromatogram of the Chenxianghuaqi tablet sample Peak Nos: 1. D-limonene; 2. camphor; 3. bornyl acetate; 4. 4,7-methanoazulene; 5. α-bulnesene; 6. patchouli alcohol; 7. n-hexadecanoic acid; 9. octadecanoic acid; 10. pentafluoropropionyl-L-prolin-pentyl ester; 11. triphenylphosphine oxide.

表 1 气相色谱指纹图谱中10个共有峰的指认Table 1 Identification of the 10 common peaks in gas chromatographic fingerprints

Standard: standard products.

表 2 20批沉香化气片气相色谱指纹图谱相似度结果Table 2 Similarity results for the gas chromatographic fingerprints of the 20 batches of Chenxianghuaqi tablets

2.7 化学模式识别

2.7.1聚类分析

将20批样品的11个共有峰的绝对峰面积作为变量,得到20×11阶原始数据矩阵,导入SPSS 20.0数据分析软件中,选取组间连接法,以欧式距离作为样品测定,计算样品的相似性程度,对样品进行系统聚类分析,结果见图4。

图 4 20批沉香化气片的聚类分析树状图Fig. 4 Cluster analysis dendrogram of the 20 batches of Chenxianghuaqi tablets

由图4可知,20批样品聚为2类,样品S17、S4、S3、S10、S14、S16、S19、S1、S2、S6、S8、S7、S20、S15聚为1类,样品S18、S13、S9、S5、S12、S11聚为1类。第1类样品批次生产日期差异较大,第2类样品批次生产日期较为接近,因此聚为一类。在制剂的生产过程中,其质量稳定性受到多种因素共同影响,不同的生产时间是导致制剂质量差异的重要因素之一。主要原因可能是原药材采摘季节不同以及不同时间的车间生产工艺、质量体系均会产生不同的影响,因此导致制剂批次之间的质量也会有所差异。

图 5 沉香化气片的主成分分析得分图Fig. 5 Scores of principal component analysis for Chenxianghuaqi tablets

2.7.2主成分分析

图 6 沉香化气片的主成分载荷图Fig. 6 Loading plot of principal component for Chenxianghuaqi tablets Nos. are the same as those in Fig. 3

将20批样品的11个共有峰的峰面积输入Excel表格内,得到20×11列数据矩阵,导入SIMCA-P 13.0软件中进行主成分分析,得到前3个主成分的累计方差贡献率为86.4%,超过85%,沉香化气片的主成分分析得分图和载荷散点图,见图5和图6。由图5可知,20批沉香化气片样品可分为为2组,样品S15、S16、S1、S19、S3、S10、S2、S4、S14、S7聚为1类,样品S20、S17、S8、S18、S6、S9、S5、S13、S11、S12聚为1类。由图6可知,载荷散点图中每一个点代表一个色谱峰,表示每个色谱峰对主成分综合作用的贡献,距离载荷图原点越远的变量,权重越大,代表该色谱峰对样本整体分布所起的作用就越大,图中1号(D-柠檬烯)、2号(樟脑)、3号(乙酸龙脑酯)、4号(4,7-methanoazulene)、5号(α-布藜烯)色谱峰在坐标系中的绝对值较大,表明其对药物的整体质量起主要作用。

3 结论

本文建立了沉香化气片的气相色谱指纹图谱,确定了11个共有峰,并测定了其中3个组分的含量,结合化学模式识别评价20批样品的质量。20批样品的相似度均大于0.9,为了更客观地反映沉香化气片的内在质量,采用各指标成分的峰面积进行不同批次样本的化学模式识别,可用于批次间的区分和归类,主要将20批样品分为2类,主成分分析结果能够反映20种样本的色谱图直观结果,找到了引起不同批次间质量差异的主要成分为D-柠檬烯、樟脑、乙酸龙脑酯、4,7-methanoazulene、α-布藜烯。以上结果表明气相色谱指纹图谱结合化学模式识别为沉香化气片的质量控制提供简单、可靠的方法。