慢性失眠患者血清胶质细胞损害标志物研究☆

李莹雪 钱婷婷 葛义俊 孔晓艺 张萍 厉雪艳 任重阳 庄战强 陈贵海

慢性失眠（chronic insomnia，CI）是临床上最常见的睡眠障碍，表现为夜间失眠和日间功能障碍（认知功能损害、情绪改变和躯体不适）[1]。其中认知功能损害是患者前来就诊的重要原因，也是近年研究热点。meta分析表明CI患者存在轻-中度认知功能（主要为记忆、注意、执行功能）损害[2]，但是其机制不明确。星形胶质细胞（astrocytes，AC）是中枢神经系统中数量最多的神经细胞，对睡眠和认知功能均具有重要调节作用[3]。AC不仅作用于视交叉上核调节睡眠的昼夜节律性[4]，还参与调节睡眠内稳态过程[5]。目前仅本课题组前期研究发现CI患者可能存在胶质细胞损伤，表现为血清S100钙结合蛋白 B （S100 calcium binding protein B，S100B）浓度升高[6]。除S100B外，胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）也是目前研究较多的AC损伤标志物，但国内外暂无CI患者血清GFAP的研究报告。本研究联合监测CI患者血清AC损伤标志物的水平，进一步验证CI患者存在AC损伤的假设，探讨CI患者血清S100B和GFAP水平改变及其与睡眠质量、认知功能的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象连续收集2017年3月至2018年7月在安徽医科大学附属巢湖医院睡眠障碍门诊以失眠为主诉的CI患者。入组标准：①符合国际睡眠障碍分类第三版中CI诊断标准[7]；②年龄18～65周岁，受教育6年或以上；③匹兹堡睡眠质量指数（Pittsburgh sleep quality index，PSQI）评分＞7分，17项汉密尔顿抑郁量表（17-item Hamilton epression scale，HAMD-17）评分＜17分。 选取同期无失眠主诉和相关病史的健康体检者 （PSQI评分＜7分、HAMD-17评分＜7分）纳入对照组。排除标准：①近期有颅脑、脊髓等神经系统损伤；②患有影响睡眠和（或）认知功能检测的内科疾病（如肝肾疾病、心血管疾病、甲状腺疾病等）、神经系统疾病（如痴呆）、精神疾病和其他睡眠障碍；③怀孕或哺乳期；④近2周有感染或炎症疾病；⑤近2周内使用镇静催眠药物；⑥有视觉、听觉和运动障碍而不能完成测试。最终纳入CI患者60例，对照组32名。本研究得到安徽医科大学附属巢湖医院伦理委员会批准 （编号：201805-kyxm-01），所有受试者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料 收集受试者姓名、年龄、性别、教育程度、疾病史、家族史等信息。

1.2.2 临床量表和记忆评估 采用PSQI、HAMD-17和蒙特利尔认知评估量表 （Montreal cognitive assessment，MoCA）分别评估所有受试者睡眠质量、情绪和总体认知水平，使用九盒迷宫[8]评估物体/空间参考记忆、物体/空间工作记忆以及物体再认记忆能力。

1.2.3 血清S100B和GFAP检测 于上午8:00-10:00抽取受试者肘静脉血约3 mL（采血前受试者空腹、避免剧烈运动以及精神刺激）。静置30 min，以3000 r/min的速度离心5 min。取血清置于-80°C保存。按照ELISA试剂盒说明书测定血清S100B和GFAP含量（美国RD公司，产品目录号DY1820-05、DY2594-05）。

1.3 统计学方法采用SPSS16.0进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用（x±s）表示，组间比较采用两独立样本的t检验。非正态分布资料用中位数及上下四分位数[M（QL，QU）]描述，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。控制年龄、性别、受教育程度、HAMD-17后，采用偏相关分别分析血清蛋白与临床量表、九盒迷宫各类记忆错误数的相关性。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 一般资料两组间年龄、性别、受教育程度均无统计学差异（P＞0.05，见表 1）。 CI组的 PSQI分高于对照组（t=28.591，P＜0.001）。

2.2 认知功能与对照组比较，CI组MoCA分降低（Z=-3.645，P＜0.001），物体工作（Z=-2.973，P=0.003）、空间工作（Z=-5.166，P＜0.001）和物体再认（Z=-2.613，P=0.009）记忆错误数均较高，但物体参考和空间参考记忆错误数组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表 2。

2.3 血清S100B、GFAP的含量CI组血清S100B（t=5.574，P<0.001）和 GFAP（Z=-4.150，P<0.001）浓度高于对照组，见表2。

表1 两组的背景资料

表2 两组间认知功能、血清S100B和GFAP含量的比较

2.4 血清S100B和GFAP与临床参数的相关性对所有受试者，控制年龄、性别、教育程度和HAMD-17分后的偏相关分析显示（见表3）：血清S100B和GFAP含量与PSQI分呈正相关（P<0.01），与MoCA分负相关（P<0.01），与空间工作记忆错误数正相关（P<0.01），GFAP还与物体再认记忆错误数正相关（P<0.01）。

当仅考察CI组时，控制同样参数的偏相关分析显示 （见表 3）：血清S100B和 GFAP分别与PSQI分正相关（P<0.01），与 MoCA 分负相关（P<0.05），GFAP 还与病程（P=0.030）、空间工作（P=0.011）和物体再认记忆（P=0.043）错误数正相关（P<0.05）。

表3 血清S100B和GFAP与临床参数的相关性（r）

3 讨论

既往认为CI仅涉及功能损害（主要为认知功能损害），但神经影像学研究显示CI患者出现部分脑区体积的变化（尤其是认知相关区域）[9]。然而目前对CI患者脑微结构的改变仍知之甚少。AC具有调节突触活动、维持离子稳态、释放胶质递质、保障血脑屏障的完整性等多种生理功能[10]。生理情况下，AC主要通过调节细胞外腺苷水平和腺苷受体参与调节睡眠内稳态[11-13]。同时，AC释放的某些神经活性分子 （如三磷酸腺苷、谷氨酸、S100B）通过调节突触可塑性，影响记忆功能[14-16]。本研究同时检测了CI患者血清GFAP和S100B浓度，结果表明CI患者血清S100B和GFAP水平同步性增加，且两者的水平均与睡眠质量及认知功能负性相关。

目前对睡眠紊乱与AC间的关系仅有少量研究。例如，短期睡眠丧失（睡眠剥夺6 h）可导致AC结构和形态发生可逆性改变[17]。虽然S100B和GFAP是较多研究的AC标志性蛋白，但仅一项研究涉及CI[6]。该研究表明CI患者血清S100B浓度升高，且经有效治疗半年后S100B浓度没有显著性降低。本研究不但验证了之前关于CI患者血清中AC释放的S100B升高的结果[6]，而且首次证明CI患者血清中AC更特异的GFAP也增加。尽管本研究显示CI患者血清S100B和GFAP浓度均与睡眠质量及认知功能负性相关，但关联程度有些差别。S100B浓度与失眠的严重程度 （由PSQI分表示）和总体认知功能损害（由MoCA分表示）呈正相关，这与之前的研究结果基本一致[6]。不同的是，血清GFAP浓度还与失眠病程和由九盒迷宫检测的空间工作和物体再认记忆损害呈正相关。这说明虽然两种血清标志物在样本的易获得性和检测成本无差异，但GFAP与临床资料关联更密切，可能更具有临床价值。

解释这种差异的原因可能是血清S100B升高并非中枢神经系统损伤患者所独有，因为S100B除存在于神经胶质细胞中，还少量存在于外周组织[18]。故以血清S100B浓度作为AC损伤的标记，虽然其敏感性高但特异性略低[19-22]。此外，低浓度的S100B（在皮摩尔至纳摩尔水平）具有神经营养作用[23]。这可能是CI患者血清S100B与多维记忆损害不相关的原因之一。另一方面，GFAP是较S100B更特异的AC标志物[24]。许多研究已证实GFAP血清水平是创伤性脑损伤的生物学标记，与脑损伤的严重程度相关[25]。研究发现，慢性睡眠剥夺大鼠（连续21 d的6 h睡眠）海马和梨状皮质的GFAP表达增加[26]。GFAP作为AC的基本骨架——中间微丝，仅存在于AC的胞体中，其血清水平可能全部来源于中枢神经系统[27]。因此血清GFAP水平可能是评估CI患者AC损伤比S100B更为可靠的指标。

总之，本研究提示血清S100B和GFAP水平有望成为诊断CI或评估CI严重程度的生物学标记，且GFAP可能更具有临床价值。本研究样本量相对较小，仅评估研究对象的主观睡眠质量，未能评估客观睡眠质量。未来仍需大量研究探索CI患者AC损伤与认知损害的因果关系。

利益冲突：无