碱性肥料和生防菌制剂配合施用对香蕉枯萎病的防效

2019-10-10樊小林

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2019年11期

桂莎，刘芳，樊小林

(华南农业大学资源与环境学院广东高校环境友好型肥料工程技术研究中心，广东广州 510642)

香蕉枯萎病(Fusariumwilt of banana)，又名巴拿马病、黄叶病，是世界香蕉产业的毁灭性病害之一，且已成为严重影响我国香蕉生产的重要土传病害。香蕉枯萎病是由古巴尖孢镰刀菌侵染而引起的一种土传真菌病害，目前尚未找到有效的防治方法[1]。选育抗病香蕉新品种存在周期长、品质难以突破、推广应用难的不足[2]，改进常规水肥管理措施也难以有效防治香蕉枯萎病[3]，因此亟需寻求新的香蕉枯萎病防治策略。相关研究表明，连作且长期过量偏施氮肥的蕉园土壤易发生严重酸化[4-5]，而土壤酸化是香蕉枯萎病菌肆虐和迅速滋生蔓延的主要原因之一。因此调节土壤pH值以改良酸性土壤，对于香蕉枯萎病防治意义重大。

目前改良土壤酸性多采用施用石灰[6-7]和一些工业副产品如钢渣[8-9]等方法，但土壤表面撒施大量石灰容易造成土壤板结，并会降低土壤营养元素的有效性[7,10]，导致石灰缓解土壤酸性的功能难以发挥[6]；采用钢渣等工业副产品改良土壤酸性可能会导致重金属污染[8,11]，因此寻求一种既能改良土壤酸性且环境友好的产品具有重大的生产实际意义。生物防治是一种安全且有潜力的植物病害防治方法[12]，国内外科技工作者已在多种作物枯萎病的防治上验证了其效果[13-14]，但目前多集中于具有拮抗功能的细菌[15]和真菌[16-17]上。放线菌作为第三类拮抗菌，已用于防治黄瓜[18]、甜瓜[19]等多种作物的枯萎病，特别是在中国北方地区取得了明显的效果。尽管有研究者尝试分离和施用放线菌拮抗香蕉枯萎病[20-21]，但由于香蕉产地土壤一般为酸性，不利于放线菌的存活繁殖，因此拮抗放线菌在酸性土壤地区的应用效果并不明显[22]。笔者前期研究表明，在常规肥水管理下，多次使用拮抗放线菌防控香蕉枯萎病，但效果甚微。因此，在酸性土壤中如何发挥放线菌的生防功能，就取决于如何改良土壤酸性，从而改善生防放线菌在土壤中的生存环境。本试验旨在开展碱性肥料和放线菌配合施用的研究，揭示碱性肥料对土壤酸性的调节作用、碱性肥料和放线菌制剂配合施用的防病效果及其对土壤生物活性的影响，为碱性肥料和生防放线菌配合施用在香蕉枯萎病防治中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试土壤盆栽试验在华南农业大学温室进行。供试土壤为酸性赤红壤土和微碱性砂壤土，其中酸性赤红壤土为无香蕉种植历史的森林土，采自华南农业大学园林场，土壤pH 4.56，有机质40.13 g/kg，矿质态氮20.47 mg/kg，速效磷8.00 mg/kg，速效钾156.39 mg/kg。微碱性砂壤土为滩涂填海造田的蕉园土壤，采自广东省中山市翠亨岛，土壤pH 7.64，有机质19.78 g/kg，矿质态氮34.67 mg/kg，速效磷50.18 mg/kg，速效钾373.50 mg/kg。

1.1.2 供试香蕉品种供试香蕉为巴西蕉(MusaAAACavendish)，选用无病组培苗进行假植。待香蕉苗长至14 cm、7片绿叶时，选取生长健壮且形态一致的苗进行试验。

1.1.3 供试生防放线菌制剂密旋链霉菌生防放线菌活菌制剂，由西北农林科技大学资源环境学院微生物资源研究室提供，有效活菌数大于20 亿/g。

1.1.4 供试肥料常规肥料(CCF)是由15-15-15(N-P2O5-K2O)的均衡型复合肥、含氮(N)46%的尿素、含钾(K2O)60%的氯化钾配制而成的复混肥，其成分为20-5-15(N-P2O5-K2O)，pH 4.18。碱性肥料(AF)为广州宜胜收农业科技有限公司制造的20-5-15(N-P2O5-K2O)碱性液体复合肥，AF水肥质量比为250∶1时溶液的pH为8.95。

1.2 试验设计

酸性土壤(A)和微碱性土壤(B)的试验方案相同，均采用盆栽试验，分别设置CCF(常规复合肥，CK)、AF(碱性复合肥)、CCF+Act(常规复合肥和放线菌制剂)、AF+Act(碱性复合肥和放线菌制剂)4个处理，共8个处理。每处理设30个重复，单株为1个重复，每盆移栽1株香蕉苗。每种土壤120盆，随机排列。所有处理香蕉的氮磷钾用量相等，N∶P2O5∶K2O(质量比)均为1∶0.25∶0.75。每个处理的施N量均为0.2 g/kg，香蕉生长过程将各处理的总养分均分为12次，分别溶于水后浇灌施肥，每周1次。

1.3 试验方法

1.3.1 生防放线菌制剂的接种 ①拌土接种法。分别按2，20 g/kg的用量取适量菌剂和园林基质有机肥，将菌剂和有机肥按质量比1∶1逐级稀释混合均匀，得到菌肥混合物；将菌肥混合物与盆栽土壤按质量比1∶1逐级混合均匀后装盆。每盆装干土4 kg。②蘸根接种法。将生防菌剂用清水稀释50倍，接种生防菌制剂处理(CCF+Act和AF+Act)的蕉苗移栽前按20 mL/株的用量将菌液均匀浇入营养杯，CCF和AF处理的蕉苗移栽前浇20 mL/株清水。

1.3.2 病原菌的扩繁与施用香蕉尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(FOC4)，由华南农业大学农学院植病研究室提供。将FOC4接种于PDA培养基上，在25 ℃下黑暗活化培养7 d。然后从菌落边缘用直径8 mm打孔器采取菌饼，接种于装有500 mL液体PDA培养基的锥形瓶中，在28 ℃、180 r/min摇床培养7 d。将得到的菌悬液用四层纱布过滤掉菌丝后，用无菌水稀释至106CFU/mL备用。

1.3.3 香蕉移栽和病原菌接种供试土壤分2层装盆，下层先装4 cm(约1.5 kg)，顶层7 cm(约2.5 kg)先不装盆，用于移栽后覆盖香蕉苗及其基质块。移栽前选取7叶1心、生长健壮一致的香蕉苗，脱掉营养钵袋，移植于已装下层土壤的盆钵正中，然后将预留的顶层土壤覆盖于香蕉苗基质块周围，使基质块上仍能覆盖1 cm土壤。每盆移栽1株香蕉，浇水至田间持水量的70%进行缓苗。香蕉移栽正常生长1个月后，采用伤根接种法接种病原菌。具体操作方法为吸取40 mL浓度为106CFU/mL的FOC4菌悬液，在盆钵中香蕉假茎四周每个方位分别接种10 mL，接种量为104CFU/g(干土)。

1.4 样品采集与指标测定

1.4.1 病情调查接种病原菌60 d后，在各处理香蕉开始出现明显的枯萎病症状时，调查香蕉枯萎病病情，每隔10 d调查1次，共调查5次，计算病情指数[23]。香蕉枯萎病病情分为6级[24]:0级,健株，无症状；1级,病株有20%以下的叶片显病症；2级,病株有20%～40%的叶片显病症；3级,病株有40%～80%的叶片显病症；4级,只有顶部1～2片健康叶；5级，整株枯死。

1.4.2 香蕉植株生物量的测定接种病原菌60 d后，每处理随机选取12株香蕉植株，测定株高并计算株高增长量。然后将其从盆钵中拔出，洗掉根上附着的土壤，单株分地上部和地下部在105 ℃杀青30 min，75 ℃烘干至恒质量。

株高增长量(cm)=收样时株高实测值-基础苗株高实测值。

1.4.3 土壤微生物数量的测定接种病原菌60 d后，每处理随机选取12盆香蕉用土钻取土，每盆取4钻，每4盆的土壤混合均匀后得到1个混合样，每处理3个混合土样。从3个混合土样中分别称取10 g新鲜土壤样品，放入90 mL无菌水中，在无菌摇床中以180 r/min振荡30 min，得到不同处理的稀释液，梯度稀释后采用稀释平板涂布法测定土壤中的细菌、放线菌和真菌数量。细菌培养用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌培养采用孟加拉红培养基，放线菌培养采用改良的高氏1号培养基。

1.4.4 土壤酶活性的测定接种病原菌60 d后，按1.4.3节的采样方法采集土样。将采集的土样过 2 mm 筛后保存于4 ℃冰箱，用于脲酶、蔗糖酶、磷酸酶和脱氢酶活性的测定。其中脲酶活性采用靛蓝比色法[25]测定, 蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水杨酸比色法[26]测定,土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法[27]测定,脱氢酶活性采用三苯基四氮唑氯化物(TTC)比色法[25]测定。

1.5 数据处理与分析

采用SPSS 20.0和EXCEL 2007软件进行数据处理,采用Origin Pro 8.1软件绘图。

2 结果与分析

2.1 碱性肥料和放线菌制剂对香蕉枯萎病的生防效果

接种FOC4病原菌60 d后，酸性土壤和微碱性土壤中的香蕉都出现了明显的枯萎病症状(图1)。各处理香蕉枯萎病病情指数统计结果(图2)表明，无论是酸性土壤还是微碱性土壤，常规肥料处理(CCF)的香蕉枯萎病病情指数均最高，分别为83.60%和80.71%；碱性肥料处理(AF)的香蕉枯萎病病情指数明显降低；碱性肥料与生防放线菌制剂配施处理(AF+Act)的香蕉枯萎病病情指数最低(P<0.05)，且碱性肥料与放线菌制剂配合施用在酸性土壤上的生防效果更明显，病情指数仅为44.55%。在酸性土壤和微碱性土壤中，碱性肥料与放线菌制剂配合处理(AF+Act)的病情指数较常规肥料处理(CCF，CK)分别降低了46.71%和33.21%。由此可见，碱性肥料能明显降低香蕉枯萎病的病情指数，放线菌制剂降低香蕉枯萎病病情指数的效果在施用碱性肥料的条件下可以得到更充分的发挥。

A.酸性土壤；B.微碱性土壤

图2 碱性肥料和放线菌制剂对香蕉枯萎病病情指数的影响

2.2 碱性肥料和放线菌制剂对香蕉的促生作用

由表1可知，在酸性土壤中，与施用常规肥料的CCF(CK)处理相比，施用碱性肥料(AF)、常规肥料与放线菌制剂配施(CCF+Act)和碱性肥料与放线菌制剂配施(AF+Act)处理均能有效提高香蕉株高增长量和其地上部及根系干质量。肥料与放线菌制剂配施(CCF+Act 和AF+Act)处理的香蕉株高增长量及地上部和根系干质量较CCF(CK)分别增加了28.05%～32.93%，34.92%～37.76%和57.49%～65.36%(P<0.05)。在微碱性土壤中，与施用常规肥料CCF(CK)处理相比，施用碱性肥料(AF)及肥料与放线菌制剂配施(CCF+Act 和AF+Act)均能显著提高香蕉的株高增长量及地上部和根系干质量(P<0.05)，三者分别较CK增加9.65%～35.96%，11.86%～24.06%和20.89%～83.55%。这说明在2种供试土壤中，均以碱性肥料与放线菌制剂配施(AF+Act)处理的香蕉株高增长量及地上部和根系干质量最高、增幅最大。

表1 碱性肥料和放线菌制剂对香蕉的促生效果

注:A代表酸性土壤，B代表微碱性土壤。同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，ΔCK表示分别与CCF(CK)相比AF、CCF+Act和AF+Act处理的增幅，下同。

Note:A represents acid soil,B represents slightly alkaline soil. Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).The increases of AF,CCF+Act and AF+Act in comparing with CCF are represented by ΔCK.The same below.

2.3 碱性肥料和放线菌制剂对土壤微生物的影响

碱性肥料和放线菌制剂对酸性土壤和微碱性土壤中土壤微生物数量的影响情况如表2所示。

表2 碱性肥料和放线菌制剂对土壤微生物的影响

由表2可知，接菌60 d后，在酸性土壤中，与施用常规肥料CCF(CK)处理相比，CCF+Act 和AF+Act处理的细菌数量分别增加了77.9%和114.9% (P<0.05)，放线菌数量分别增加了53.3%和153.9% (P<0.05)，真菌数量分别减少了9.8%和42.3% (P<0.05)；细菌/真菌值和放线菌/真菌值均显著增大。在微碱性土壤中，与施用常规肥料CCF(CK)处理相比，碱性肥料(AF)、CCF+Act 和AF+Act处理土壤细菌数量分别增加了21.5%，20.5%和37.0%(P<0.05)，AF+Act处理土壤放线菌数量增加了13.0%(P<0.05)；CCF+Act 和AF+Act处理土壤真菌数量分别减少了41.5%和57.7%(P<0.05)；与CCF(CK)处理相比，碱性肥料(AF)、CCF+Act 和AF+Act处理土壤细菌/真菌值、放线菌/真菌值均有所增大，且均以AF+Act处理增幅最大。可见，施用碱性肥料以及碱性肥料与放线菌制剂配施可以增加土壤细菌和放线菌数量，减少真菌数量，进而使细菌/真菌值和放线菌/真菌值增大，使土壤微生物区系向有利于作物生长的类型转变。

2.4 碱性肥料和放线菌制剂对土壤pH值的影响

碱性肥料和放线菌制剂对供试土壤pH值的影响如表3所示。

表3 碱性肥料和放线菌配施对土壤pH的影响

由表3可以看出，无论是酸性土壤还是微碱性土壤，施用碱性肥料(AF)均能显著提高土壤pH值(P<0.05)，AF处理的土壤pH分别较CCF(CK)提高了0.17和0.22,且在2种土壤中，均以AF+Act处理的土壤pH值最高。这说明在香蕉的生长过程中，施用碱性肥料可有效地调节土壤pH值，防止因施用常规肥料带来的土壤进一步酸化问题，为香蕉健康生长提供适宜的土壤环境。

2.5 碱性肥料和放线菌制剂对土壤酶活性的影响

蔗糖酶可水解不能被植物直接吸收的蔗糖而生成葡萄糖和果糖，其活性大小可以间接表征土壤中有机碳的转化情况[25]。由表4可以看出，施用碱性肥料(AF)以及肥料与放线菌制剂配施(CCF+Act 和AF+Act)土壤的蔗糖酶活性分别较CCF(CK)增加了30.61%，23.96%和38.79%(P<0.05)。在微碱性土壤中，碱性肥料(AF)和AF+Act处理土壤蔗糖酶活性分别较CCF(CK)增加33.91%和44.35%(P<0.05)。无论是酸性土壤还是微碱性土壤，均以AF+Act处理土壤的蔗糖酶活性最高。

表4 碱性肥料和放线菌配施对土壤酶活性的影响

土壤磷酸酶可以分为酸性磷酸酶(最适pH 4～5)、中性磷酸酶(最适pH 6～7)和碱性磷酸酶(最适pH 8～10)3种，每种磷酸酶的活性因土壤条件不同而表现各异[29]。土壤磷酸酶与磷的转化紧密相关，能将土壤中的有机态磷转化为可被植物吸收利用的无机态磷[30-31]。在本试验中，2种供试土壤的原始pH分别为4.56和7.64，故只分别测定了酸性磷酸酶活性和碱性磷酸酶活性。由表4可知，在酸性土壤中，与施用常规肥料的CCF(CK)处理相比，施用碱性肥料(AF)以及肥料与放线菌制剂配施(CCF+Act 和AF+Act)处理均能提高土壤酸性磷酸酶活性，AF和CCF+Act处理土壤酸性磷酸酶活性分别较CCF(CK)增加了2.49%和2.64%，AF+Act处理酸性磷酸酶活性较CCF(CK)增加了6.88%(P<0.05)。在微碱性土壤中，AF和AF+Act处理土壤碱性磷酸酶活性均较CCF(CK)处理显著提高(P<0.05)，增幅分别为5.58%和6.63%。

脱氢酶能酶促脱氢反应，起着氢的中间传递体的作用。脱氢酶能从基质中析出氢而进行氧化作用，因其存在于微生物细胞内，故其活性大小可直接反映土壤微生物的数量和活性。由表4可以看出，在酸性土壤中，AF和AF+Act处理土壤的脱氢酶活性分别较CCF(CK)显著增加，增幅分别为56.62%和37.52%(P<0.05)。在微碱性土壤中，AF处理土壤脱氢酶活性较CCF(CK)提高了24.34%；CCF+Act和AF+Act处理土壤脱氢酶活性较CCF(CK)显著提高,增幅分别为154.95%和163.33%(P<0.05)。

2.6 香蕉枯萎病病情指数与土壤微生物、土壤酶活性的相关性

通过对香蕉枯萎病病情指数与土壤微生物、土壤酶活性的相关性进行分析。结果(表5)表明，在酸性土壤和微碱性土壤中，香蕉枯萎病病情指数与细菌/真菌值、放线菌/真菌值均呈显著负相关。酸性土壤中，香蕉枯萎病病情指数与细菌/真菌值的负相关性最高。微碱性土壤中，香蕉枯萎病病情指数与细菌/真菌值、放线菌/真菌值的负相关性最高，这说明优化土壤微生物环境有利于防治香蕉枯萎病。无论在酸性土壤还是微碱性土壤中，香蕉枯萎病病情指数与脲酶和蔗糖酶的负相关均达到显著水平，但与脱氢酶的相关性不显著，这说明增强土壤酶活性有利于土壤生物活性的增加，进而增强香蕉植株的抗病性。

表5 香蕉枯萎病病情指数与土壤微生物、土壤酶活性之间的相关性

注: *表示相关性在5%水平差异显著；**表示相关性在1%水平差异显著。

Note:*indicates correlation is significantly different at the 5% level; ** indicates correlation was significantly different at the 1% level.

3 讨论

防止香蕉枯萎病发生的必要条件是增加土壤微生物的多样性，充分条件是改良土壤酸碱环境，促进有益微生物的生长和繁殖。本研究利用碱性肥料治酸改土，配施生防放线菌制剂增加土壤微生物多样性，从而防治香蕉枯萎病。研究结果表明，施用碱性肥料提高了土壤pH值，且能有效地防治香蕉枯萎病，这与以往研究报道的较高土壤pH值可以提高香蕉对枯萎病的抗病性[32-33]的结果一致。也有研究表明，土壤pH值与枯萎病病原菌的增殖、发病、病情指数之间呈显著的负相关关系[3,34]，其可能原因是高pH值对真菌细胞有严重的胁迫作用，使其难以吸收营养或者减少了营养元素的有效性[35]。放线菌作为生防菌已在防控黄瓜[36]、马铃薯[37]等作物的枯萎病上有很多报道，表明放线菌用于生物防控具有极大潜力。本研究发现，在施用碱性肥料的条件下再配施放线菌制剂，能充分发挥放线菌制剂的防病效果，这不仅肯定了放线菌对香蕉枯萎病的防效[38-39]，而且进一步揭示在香蕉园发挥放线菌制剂生防效果的充分条件是施用碱性肥料，以改变致病菌生长的生态环境。

土壤微生物组成是抑制土传病害的主要驱动力[40]，土壤微生物群落组成或者亚种群丰度的改变可作为土壤抗病能力的衡量指标[41]。本研究表明，与施用常规肥料(CCF)相比，施用碱性肥料和生防放线菌制剂可以显著提高土壤细菌和放线菌的数量，降低真菌数量，这与前人的研究结果[42]一致。已有研究表明，从香蕉根际分离的放线菌对香蕉枯萎病有拮抗作用[38-39]。本研究中，碱性肥料和生防放线菌制剂配施(AF+Act)能较好地防治香蕉枯萎病，其可能原因是碱性肥料提高了蕉园土壤的pH值，使其不利于病原真菌的繁殖和生长，而偏中性环境有利于细菌和放线菌生长，进而提高其在土壤中的数量，使香蕉根际土壤由真菌主导型向细菌主导型转变，在香蕉根际形成的大量拮抗放线菌成为抵御香蕉枯萎病的生物屏障。

土壤酶活性是反映土壤质量的一项重要生物学指标[43]，可用于评价土壤营养物质的转化、循环情况，反映土壤的综合肥力特征和健康状况[44]。土壤酶活性受到多种生物和非生物因素的影响[45]，土壤微生物是土壤酶的一个重要来源[46]。脲酶主要来自于植物和微生物，可以反映土壤中N的供应情况[47]，本研究表明，在2种供试土壤中，碱性肥料和放线菌制剂配合施用均能显著提高土壤脲酶活性，说明其对脲酶有激活作用，从而提高氮素利用率。蔗糖酶与土壤碳关系紧密，影响碳循环和土壤微生物丰度[48]，已有研究表明，抗病土壤有更高的蔗糖酶活性[49]。本研究结果表明，在2种供试土壤上，碱性肥料和放线菌制剂配合施用后，土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶和脱氢酶活性均显著高于常规肥料处理，且香蕉枯萎病的病情指数显著低于常规肥料处理，因此可以认为土壤酶活性与土壤抗病性呈正相关。碱性肥料和放线菌制剂配合施用增加土壤酶活性的原因可能是碱性肥料和生防放线菌配施后，与土壤中的微生物互相协同促进，使土壤微生物的代谢更加旺盛。土壤酶活性的增强提高了土壤综合肥力，促进了香蕉的健康生长，进而提高了香蕉抗枯萎病的能力。

本试验对土壤微生物的研究是从土壤细菌、放线菌、真菌三大类微生物数量的变化入手的，后续试验将借助分子生物学手段，从微生物群落结构层面探究碱性肥料和生防放线菌配施对土壤微生物丰度和多样性的影响，进而找到具有抑制尖孢镰刀菌丰度变化的微生物种属信息。