云南省新型隐球菌药物敏感流行病学折点的建立*

樊红丽，高 丽，杨翠先，张 米，李正伦，杜 艳，刘德华，毛小琴

(1.云南省传染病医院/艾滋病关爱中心，昆明 650301；2.昆明医科大学第一附属医院，昆明 650032；3.昆明市第一人民医院 650011；4.昆明理工大学医学院，昆明 650500；5.云南省第一人民医院,昆明 650032)

目前,美国临床实验室标准化委员会(clinical and laboratory standards institute,CLSI)对治疗新型隐球菌6种常见的抗真菌药物中，只有5-氟胞嘧啶和氟康唑有药敏流行病学折点(epidemiologic cutoff value，ECV)。2016年，范欣等[1]对中国人群的新型隐球菌流行病学折点进行研究，选取了中国北京、天津、上海、辽宁、四川等地进行多中心研究，建立了中国人群新型隐球菌的药敏折点。但是，由于微生物的地区差异性和耐药机制的变化性，CLSI建议根据标准建立各自实验室药敏的参考值范围[2]。得到ECV的方法有几种，一种是简单地绘制最低抑菌浓度(minmum inhibitory concentration，MIC)值的分布图[3]，是操作者通过视觉设置得到的ECV值。另一种更科学的方法是用MIC95来得到ECV[4],即把95%以上菌株的MIC值包含在内得到的ECV。使用MIC95设置ECV有些问题，比如，如果没有尾部分布在高端，那么ECV就会设置得很低。因此，产生了一种ECV的计算方法，就是使分布在下端的菌株占比更大[5],即CLSI出版的MIC97.5；就是使97.5%菌株的MIC值包含在内得到的ECV[2]。

本研究选取云南省3家独立的医疗机构实验室收集的总共324株新型隐球菌菌株，对6种常用抗真菌药物：两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑进行药敏实验，旨在初步建立云南省新型隐球菌对6种抗真菌药物的流行病学折点。

1 材料与方法

1.1菌株来源 本研究所使用324株新型隐球菌菌株均分离自2007年1月至2018年8月的临床艾滋病患者，其中男236例(72.8%)，女88例(27.2%)，年龄34～79岁，平均(44.4±13.2)岁，患者分别来自云南省16个地州。

1.2菌株的复核鉴定 所有菌株经复苏培养后进行复核鉴定，鉴定方法为使用全自动微生物鉴定仪VITEK2的真菌鉴定卡(YST)进行鉴定。

1.3药物敏感性实验 3个独立的实验室按照相同的标准，严格按照Thermo Fisher公司试剂盒说明书进行药敏实验。实验同时设置标准菌株克柔念珠菌ATCC 6258和近平滑念珠菌ATCC 22019进行质量控制。

1.4野生型菌株的定义及ECV的建立 野生型菌株是指不携带任何的获得性或耐药机制的菌株[6]。ECV的建立方法根据CLSI M57文件[2]，即MIC97.5。

1.5统计学处理 采用SPSS19.0统计软件对6种抗菌药物的MIC菌进行频数分析。

2 结 果

2.1菌种分布 来自云南省3个不同的实验室临床分离的艾滋病合并新型隐球菌感染的324株菌株，经复核鉴定均为新型隐球菌。从标本来源来看，隐球菌菌株更容易透过血脑屏障进入血液和脑脊液，引起临床症状，见表1。

2.2324株新型隐球菌对6种常用抗真菌药物的敏感性 汇总3个实验室324株新型隐球菌的药敏数据，得到其MIC值分布情况，见表2。

表1 324株不同实验室的新型隐球菌分布情况(n)

-:为无数据

2.3新型隐球菌药敏的流行病学折点 6种抗隐球菌药物的MIC值分布基本呈正态分布，但泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑的MIC分布明显低于氟康唑，经统计学处理，5-氟胞嘧啶的野生株有14株(4.3%)，两性霉素B的野生株有5株(1.5%)，伏立康唑的野生株有4株(1.2%)，泊沙康唑和伊曲康唑的野生株分别有2株(0.6%)和1株(0.3%)，氟康唑的野生株有1株(0.3%)。6种抗真菌药物的流行病学折点为5-氟胞嘧啶8 μg/mL，泊沙康唑0.25 μg/mL，伏立康唑0.12 μg/mL，伊曲康唑0.25 μg/mL，氟康唑16 μg/mL、两性霉素B 1 μg/mL，见图1。

表2 324株新型隐球菌MIC值分布情况(μg/mL)

图1 新生隐球菌菌株MIC值分布、流行病学药敏折点以及野生型菌株累积百分率

3 讨 论

中枢神经系统一旦受到病原菌的侵犯，血脑屏障将会被破坏，导致较高的病死率和致残率。而在中枢神经系统真菌感染中，由新型隐球菌感染引起的隐球菌性脑膜炎是最常见的。据估计，全球每年约有100万隐球菌性脑膜炎病例，其中62.5%死亡[7]。隐球菌性脑膜炎常感染免疫力低下人群，尤其是艾滋病患者。近年来，随着艾滋病患者增多，隐球菌性脑膜炎发生率也显著上升。隐球菌性脑膜炎病死率较高，如未经治疗，病死率为100%，是艾滋病患者死亡的主要原因之一[8]。隐球菌性脑膜炎的治疗效果差，病死率高。降低该病病死率主要是降低颅内压和抗真菌治疗两方面。最常见的抗隐球菌药物为5-氟胞嘧啶、两性霉素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑6种。美国感染学会(DSA)推荐两性霉素B联合5-氟胞嘧啶为首选的病原治疗方案；同时，唑类药物作为贯序治疗和维持治疗[9]。但是，在治疗过程中，隐球菌会对抗真菌药物产生耐药性,使治疗失败。因此，临床治疗需要有实验室的体外药物敏感性报告作为依据。目前,CLSI对治疗新型隐球菌6种常见的抗真菌药物中，只有5-氟胞嘧啶和氟康唑有药敏ECV。

ECV是基于表型将细菌群体分为无获得性的耐药机制和(或)突变性的耐药机制的MIC值[2]。MIC值是指按照标准操作规程进行真菌药物敏感试验时，在特定培养时间内，能完全或显著抑制真菌生长的最低药物浓度。不同的方法做出MIC值后计算出来的ECV值是不同的，已经有文献对一些真菌微生物的ECV进行报道[1-2，10]，然而，这些ECV的数据并不是遵循相同的标准得到。目前制定真菌药物敏感性实验，药敏折点及ECV的发展标准的组织仅有CLSI和欧盟抗生素敏感试验委员会(European Union Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)。使用CLSI方法建立的ECV[2]必须包括至少100个不相关分离菌株的MIC值，必须来自至少3个独立的实验室,所有的值必须保证用相同的方法检测，并且室内质控在控的情况下才有效；任何参与实验室菌株的MIC值不能落在测试所得的MIC范围最高值或最低值上，这样才能确保在测试更高或更低的稀释度时，不会产生低于或高于模式cut/off值。

本研究按照CLSI制定标准，在云南省3家独立的实验室，按照相同的标准，使用比色微量稀释法，对总共324株新型隐球菌菌株进行6种常见抗真菌药物药物敏感性实验，得到云南省新型隐球菌对6种常见抗真菌药物的MIC值分布情况。根据MIC97.5的MIC值即为ECV值，初步得到云南省新型隐球菌对常见6种抗真菌药物的ECV，在本研究结果中，泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑和两性霉素B与范欣等[1]对中国多中心建立的新型隐球菌的ECV一致，但是5-氟胞嘧啶的ECV低于范欣等[1]的研究结果。同时与文献[10-11]对全球ECV的研究结果不完全一致，说明不同地区ECV有差异[12-17],推测可能原因是研究对象为艾滋病患者合并隐球菌的菌株，为免疫缺陷的患者分离菌株，患者机体的免疫功能与普通患者的免疫状态有差异，使其菌株对抗真菌药物的敏感性也有所差异；也有可能为HIV感染的影响，使得菌株对药物敏感性有所不同[10]；再者不同的实验方法对药物敏感性结果会有差异，最终使得计算的ECV有所不同[10]，提示建立云南省的新型隐球菌ECV至关重要。

在本研究中，发现5-氟胞嘧啶和两性霉素B的非野生株在6种抗真菌药物中是较高的，分别占4.3%和1.5%，与ESPINEL-INGROFF等[10]的研究结果新型隐球菌对5-氟胞嘧啶和两性霉素B的非野生株分别占1.4%～4.3%和0～2.8%相符。其余4种唑类药物的非野生株低于相关报道[1，11]。推测原因为本研究的菌株来自艾滋病患者，而云南省是艾滋病高发地区，近几年已从艾滋病的重灾区转变为示范区，对艾滋病的机会性感染特别是新型隐球菌感染诊疗逐步规范，使得这6种常规抗隐球菌药物对新型隐球菌的非野生株的占比低于全球性的研究报道。

综上所述，本研究对云南省艾滋病患者新型隐球菌感染菌株抗真菌药物的MIC值进行系统描述，初步得到云南省艾滋病患者中新型隐球菌对6种常用抗真菌药物的ECV，为今后本地区ECV和国家临床折点的建立提供数据支持。在本研究中还有不足的地方，第一，3个独立的实验室提供的菌株不够均衡，使得单独一个实验室的检测结果对整体结果影响很大，所以本次实验采用成品试剂盒，最大限度地减少实验误差，同时接下来需要再收集多家实验室的菌株进一步完善检测并进行分析。第二，新型隐球菌不同变种的ECV也有所不同，本实验没有对菌株检测到变种水平，接下来还需要完善变种的检测，对实验结果进行分析。第三，未采用不同的微量稀释法进行对比试验，使得本研究的结果仅对比色微量稀释法检测。