丸剂物料的不同配比组成对其体外溶出的影响研究＊

马彦江，王 娇，刘瑞霞，陈天朝,＊＊

（1.河南中医药大学第一附属医院 郑州 450000；2.河南中医药大学 郑州 450008；3.中牟县中医院 郑州 451450）

丸剂指药物与适宜的辅料，经适当的方式制成的球形或类球形固体制剂[1]，因其含有大量的淀粉、纤维、多糖等物质，具有不同的理化性质和辅料功能，因此是所谓的天然辅料[2]。中药材就具有功能、药辅合一的特点，但从目前研究和相关文献报道看，影响制剂因素包括有效成分性质、粉料细度、泛丸速度、丸粒大小、干燥方法、包衣等[3]，对中药物料既是药效成分，又能影响制剂成型和释放的研究却鲜有报道[4,5]。李丽等人研究发现，中药辅料有类似“骨架材料”、“微囊”、“微球”等作用[6]，能影响制剂释放。程伟[7]等人，通过研究中药对通脉丸士的宁和马钱子碱体内外释放的影响，发现纤维类与淀粉类物料对士的宁成分的溶出有促进作用，相反，油脂类与树脂类对士的宁有抑制溶出的作用。陈天朝[8]等人，以总黄酮含量为考察指标，测定其溶出度，发现中药纤维类的含量与水丸溶出度呈正相关。

中药的药物组成分与其他类型药物相比较多，且制作工艺对组分的影响较大，因此本文提出溶出度的测定实验对此进行考察。溶出度的测定对制剂处方及工艺条件的筛选有重要参考价值，避免研制工作中的盲目操作，清楚反映药物在体内的吸收及药效情况[9]。体外溶出对实验的研究过程至关重要[10]，固体药物制剂的体外溶出度数据是评价一种药物制剂不同品种、不同批次间质量的重要数据[11]，故应运而生一种评价固体制剂内在品质的科学手段与方法，此类文献中进行相关性的测试大多采用溶出曲线[12,13]。

根据前期课题组研究基础，结合中药丸剂实际生产需要及各类中药临床使用情况，从确定的7 类物料中优选出纤维、淀粉、多糖、油脂、蛋白作为本次实验所研究的物料类型，再根据各类物料中饮片含量及相关物料参数等数据，选择纤维类升麻、淀粉类山药、多糖类茯苓、油脂类火麻仁、蛋白类僵蚕作为本次模型丸剂物料饮片。通过调整中药物料用量比例制备丸剂，利用HPLC 和紫外分光光度计测定其体外溶出度，研究中药丸剂溶出过程，实现速释或缓释，达到控制药效的目的，从而更好地提高中药生物利用度[14]。

表1 各模型丸剂均匀设计处方比例

1 实验仪器及材料

1.1 实验仪器

真空干燥箱MG12（常熟市中药制药机械有限责任公司）；20B 万能粉碎机（江阴市盛田机械制造有限公司）；Thermo Evolution 201 紫外可见光分光光度计（美国赛默飞）；ZRS-8C智能溶出试验仪（天津大学无线电厂）；GP225D 电子天平（德国赛多利斯）；1260 高效液相色谱仪（安捷伦公司）；18120纯水装置（上海摩勒科学仪器有限公司）；DL-I-15 高级台式封闭电炉（天津市泰斯特仪器有限公司）；AP-01P 抽滤泵（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；GZX-9070MBE 数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；HY-4调速多用振荡器（江苏金坛市中大仪器厂）；G100自动脂肪测定仪（上海晟声仪器有限公司）；250 ml 回流装置、量筒、玻璃坩埚等玻璃仪器由河南中医学院第一附属医院提供。

1.2 实验材料

黄连（批号：1801111）、升麻（批号：1804191）、山药（批号：1804173）、僵蚕（批号：1801091）、火麻仁（批号：1803241）、茯苓（批号：18042544）均购置安徽普仁中药饮片有限公司，饮片经河南中医药大学第一附属医院陈天朝主任药师鉴定，符合2015 版《中华人民共和国药典》（一部）饮片项下各项规定。

色谱乙腈（Sigma 试剂有限公司，H1208X45502）；磷酸（北京迪马公司，色谱纯）；盐酸小檗碱（中国食品药品检定研究所，110713-201212-20 mg，纯度≥98%）；甲醇（Sigma 试剂有限公司，色谱纯），95%无水乙醇（Sigma试剂有限公司，20180910）；磷酸二氢钾（天津市永大化学试剂有限公司，分析纯）；十二烷基硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 盐酸小檗碱色谱条件

①采用AgiLent SB-Aq（5 um，4.6 mm×250 mm）色谱柱；②流动相：乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（50：50），每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节PH 值为4.0；③流速：1.0 mL·min-1，柱温30℃，检测波长345 nm[14]。

2.1.2 紫外检测条件

取盐酸小檗碱对照品溶液，利用紫外分光光度计，以空白溶剂作对照，在200-700 nm 波长范围内扫描,349 nm处有最大吸收,确定样品测定波长为349 nm。

2.2 模型丸剂的制备

采用多因素多水平均匀设计法进行制剂的组方，把5种药物看作影响丸剂溶出的五种物料因素。为便于研究需要，分别将5种药材粉碎过80目筛，使用V型混合机混合粉末，混合时间设为30 min，处方量 500 g。泛制丸剂时糖衣锅的转速25 r·min-1，丸剂成型后,在真空干燥箱65℃,烘干10 h,干燥过程中每2 h翻动一次，以防止局部受热不均衡,干燥后丸重16 mg，此为模型丸剂。通过均匀设计法U8*(85)，将升麻、山药、茯苓、火麻仁、僵蚕作为五个因素，丸剂总处方中辅料含量作为8 个水平，处方中5 个中药细粉具体比例见下（表1）。以泛制法[15,16]制丸、干燥，制备8 批工艺参数相同而辅料配比不同的两组丸剂[17]，处方中分别加入含量相等的指标成分（盐酸小檗碱、黄连提取物）。另选择处方3辅料比例不加指标成分，制成阴性丸剂。

2.3 对照品溶液的制备

2.3.1 盐酸小檗碱

精密称取盐酸小檗碱对照品10.0 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，再精密吸取该溶液1 mL 置25 mL量瓶中，加甲醇配制成39.5 μg·mL-1的盐酸小檗碱对照品溶液。

2.3.2 黄连提取物

取黄连（片）15 g，加入65%乙醇配置成120 ml，投入多功能提取罐，回流提取3 次，70℃减压浓缩干燥，将所得提取物浓缩液倒入真空干燥箱，70℃减压干燥8 h，得黄连提取物。

2.4 物料含量测定

2.4.1 纤维素含量测定

将升麻粉碎，平铺于称量瓶中，于105℃下干燥5 h，取滤袋，称取一定重量，上端打孔后，固定于样品架上依次经酸洗、水洗、碱洗、水洗、脱脂、干燥、炭化、灰化等，称重计算差值得出纤维素含量。

2.4.2 多糖含量测定

配置浓度为0.005 7 mg·mL-1的无水葡萄糖对照品，在300-900 nm波长范围下测最大吸光度。称取茯苓加入16 倍量蒸馏水，78℃超声提取48 min，离心，上清液用氯仿-正丁醇（4∶1）萃取2 次，水层加4 倍量95%乙醇，放入冰箱静置过夜，滤过，残渣用95%乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，干燥，得粗多糖，粗多糖加蒸馏水定容至50 mL，精密吸取1 mL 溶液加蒸馏水定容至25 mL得样品溶液，在最大吸收波长下，测定供试液的吸光度值，计算茯苓多糖提取率[18]。

2.4.3 脂肪、淀粉含量测定

制备1 mg·mL-1支链和直链淀粉对照品溶液，绘制标准曲线。将样品放105℃鼓风干燥箱中烘干5 h，烘干后放入索氏脂肪提取器中，加入石油醚（30-60℃），加热回流4 h进行脱脂，再加入85%乙醇，加热回流4 h进行脱糖，然后放入105℃鼓风干燥箱中烘干，冷却，称重，测得脂肪含量。称取脱水脱糖样品0.10 g，用少量无水乙醇将其湿润，再加入1 mol·L-1氢氧化钾溶液10 mL，沸水浴中进行10 min 的分散溶解，加蒸馏水定容至50 mL，混匀，吸取样品液4 ml,加入20-30 mL 双蒸水，用0.1 mol·L-1盐酸调节PH至3.0，加0.5 mL碘试剂，用蒸馏水定容。采用UV测得吸光度值，依据回归方程求出样品溶液中直链淀粉浓度Y值（ug·mL-1）和支链淀粉浓度Y值（ug·mL-1），从而得淀粉类中药中直链淀粉、支链淀粉和总淀粉的含量[19]。

2.5 溶出度试验

按2015 年版《中华人民共和国药典》收载的测定第二法（浆法）。溶出实验以900 mL 纯化水为溶出介质，转速100 r·min-1，温度（37±0.5）℃[14]，实验前预热30 min，于2、5、10、20、30、60、120、240、480 min分别取样，取样后及时补充相应量溶出介质。

表2 盐酸小檗碱线性关系考察

图1 盐酸小檗碱标准曲线图

2.6 盐酸小檗碱方法学考察

2.6.1 标准曲线建立

取2.3.1项下盐酸小檗碱对照品溶液，分别进样4、6、8、10、12、14 μL，以进样量对峰面积进行线性回归，得回归方程：Y=3786.4X-22.76（R²=0.999 9）。结果表明盐酸小檗碱在0.158 0-0.553 0 ug·mL-1范围内线性关系良好（表2，图1）。

2.6.2 精密度实验

精密称定同一模型丸剂6份，取供试品溶液，于当日内连续进样5 次，记录峰面积，计算所得RSD=0.77%，表明精密度良好。

2.6.3 稳定性实验

精密称定模型丸剂，于供试品溶液制备后的0、2、4、8、12、24 h，按确定的色谱条件进样测定，计算其RSD=0.72%，表明供试品溶液在24 h稳定。

2.6.4 重复性实验

精密称定同一模型丸剂6份，按确定的溶出条件，取4 h 溶出液分别进样测定，记录峰面积，计算所得RSD=1.08%，表明样品处理和液相方法的重复性良好。

2.6.5 加样回收率考察

取模型丸剂6 g，平行取6 份得溶出液，分别加一定量对照品溶液，0.45 μm 滤膜过滤，按确定的色谱条件进样测定，结果平均回收率为95.11%，RSD=0.80%。

2.6.7 定量限与检测限考察

取上述已配置盐酸小檗碱对照品溶液，倍比稀释，当信噪比为10∶1 时，盐酸小檗碱最低检测质量为0.01 μg·mL-1；当信噪比为3∶1 时，盐酸小檗碱最低检测质量浓度为0.003 μg·mL-1，满足分析的要求。

2.7 黄连总生物碱方法学考察

2.7.1 标准曲线建立

精密吸取过0.45 μm微孔滤膜的溶出液适量稀释定容至适宜浓度，置于具塞刻度的比色管中，以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标，标准曲线方程：Y=63.69X+0.018 9（r=0.999 3）。结果表明，在0.002 8-0.013 9 mg·mL-1范围内，对照品与吸光度呈良好的线性关系（表3）。

表3 黄连总生物碱线性关系考察

2.7.2 精密度实验

取同一模型丸剂4 h溶出液，于当日内连续5次测定其吸光度，计算RSD=0.25%，结果表明该仪器日内精密度良好。

2.7.3 稳定性实验

取3.4.1 项下稳定性实验，按照确定的溶出条件，取4 h的溶出液处理后于0、2、4、6、10、12 h测定其吸光度，测定其吸光度，由RSD=0.31%，可知该供试品溶液稳定性良好。

2.7.4 重复性实验

取任一处方模型丸剂6 g，平行取6 份，同3.4.1 项下重复性实验，测定其吸光度并计算RSD 值，RSD=1.85%，表明该方法重复性符合规定。

2.8 物料的测定结果

五种物料含量：山药（58.55%）＞火麻仁（38.01%）＞升麻（27.21%）＞茯苓（20.11%）＞僵蚕（21.5%），依次减少，但相对都较高，其处方比例对丸剂具有一定影响（表4）。

表4 各物料含量测定结果

2.9 指标成分溶出实验结果

根据确定溶出方法及色谱条件，分别在2、5、10、20、30、60、120、240、480 min取样液，选择溶出480 min的溶出总量作为溶出100%，HPLC 测定样液中盐酸小檗碱的含量，8 个中药丸剂各时间点下溶出液中指标成分累积溶出率（图2）。处方7 累计溶出率最先达到最大，丸剂组成中山药含量最高；处方3 为阴性对照，处方4累积溶出率最小，组成中茯苓含量最高。

图2 盐酸小檗碱累积溶出百分率

2.9.1 黄连总生物碱溶出实验结果

各处方中药丸剂，用紫外分光光度法在2、5、10、20、30、60、120、240、480 min取样液进样测定各丸剂体外释放（图3）。

图3 黄连总生物碱累积溶出百分率

处方7 累计溶出率最先达到最大，丸剂组成中山药含量最高；处方4累积溶出率最小，组成中茯苓含量最高。由图2和图3知，8个处方中盐酸小檗碱和黄连总生物碱的累积溶出百分率具有显著差异。如处方七与处方三，二者间的溶出差异高达2 倍。其次，8 批丸剂溶出出现拐点处时间为30 min左右，溶出变化最大，其后曲线趋势逐渐平缓，溶出变化不大。

2.10 中药物料与溶出参数关系

根据中药丸剂指标成分的累积溶出百分率，运用Excel（2007）软件，计算威布尔（Weibull）分布模型[20]，分别拟合并估算各模型处方中单一指标成分及总组分的溶出参数Y（Y为丸剂指标成分药物溶出30%时，各处方模型的溶出时间（T30）），SPSS 进行线性回归[21,22]，分析，建立模型，根据上述公式拟合并估算出两组模型丸剂指标成分溶出参数T30（图4）。

知盐酸小檗碱和黄连总生物碱溶出趋势相似，由此可说明中药丸剂辅料组成对体外溶出度影响基本一致（图4）。

为研究中药物料与丸剂溶出释放度的关系，引入多元线性数学模型[14]。该数学模型反应五类物料与丸剂溶出度的量变关系[23]。以盐酸小檗碱为考察指标，测定8 种丸剂的溶解度，根据SPSS20.0 建立回归模型分析表可知，物料性质与溶出参数之间关系：YT30=0.380--0.116x2+0.023x1x4+0.561x5，以黄连生物碱为指标建立方程：YT30=0.008--0.084x2+0.019x1x4+0.471x5，其中Y代表8个处方指标成分在不同时间点下的溶出百分率，T30代表指标累积溶出30%的时间，x1-x5为纤维类升麻、淀粉类山药、多糖类茯苓、蛋白类僵蚕、油脂类火麻仁所占处方含量比率。从上述可看出x1、x2与Y呈负相关，x4、x5与Y 呈正相关；从相关性可看出，、x2、x3有促进溶出作用、x1x4、x5有抑制溶出作用，因此可说明x4有抑制溶出的作用，促进溶出的能力：x2＞x3＞＞x1x4＞x5。纤维类、淀粉类以及多糖类物料较难区分，且从材料学上讲，这三类都应为归属为多糖类，它们的化学结构都是（C6H10O5）n，通过中药物料与溶出参数之间的关系方程得出：纤维、淀粉类对模型丸剂中盐酸小檗碱、黄连总生物碱有显著的溶出作用（P＜0.05）；蛋白类、油脂类对丸剂中指标成分有显著的抑制溶出作用(P＜0.05)；多糖类物质对丸剂中指标成分的溶出无显著作用。

3 讨论

3.1 物料分子组成

中药物料因所富集的成分不同，表现出不同的特征如粉性、纤维性、黏性等，大体分为纤维类、淀粉类、杂多糖、油脂类、树脂类、矿物类等7 个基本类型。丸剂组成复杂，由多种药物混合制作而成，因理化性质不同，对溶出度的影响亦不同[3]。细胞吸水后溶胀，成分易溶出，水分子先后透过细胞壁及细胞膜进入内部，进行溶解，然后经扩散进入到体液中[3]。淀粉经长链分子卷曲成螺旋形，形成淀粉簇结构[24]；油脂主要成分是高脂肪酸甘油三酸酯，化学结构可分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸；纤维素是一种天然有机高分子材料，细胞中含有较多特殊结构的毛细血管；蛋白质由原子间三维关系组成，分四级结构；植物多糖是聚合度超过10个的聚糖，由α-或β-糖苷键连接许多相同或不同的单糖[25]。

表5 两指标成分溶出参数T30

图4 两指标成分溶出度T30折线图

3.2 物料性质对丸剂溶出影响

淀粉、纤维类物料，水份易通过纤维性毛细管，加之淀粉吸水作用较强，吸水后膨胀，丸剂的溶出时间一般较短[3]。油脂类物料遇热变软，促使药粉排列更加紧密、毛细孔径细小；蛋白类物料增加疏水性，减缓成分溶解与扩散；当选取含有大量黏液质、蛋白类、蜡质类、脂肪油脂类等中药物料，因它们本身具有阻滞剂的作用，内部会形成不溶性骨架，会改变性质，或增加粘性，或增加疏水性，从而减缓丸剂内成分的扩散[3]。多糖的相对分子量越大，水动力体积越大，越不利于多个细胞膜屏障被动扩散进入机体发挥生物活性；降低相对分子质量可增加多糖的溶解度，从而增强多糖的活性。但是，如果相对分子质量太低，就不能形成活性聚合物结构，导致多糖活性的丧失[26]。

3.3 溶出度实验

溶出度作为一种可以通过体外试验替代体内试验的方法，对处方筛选、工艺条件优化，寻找各种制剂在临床运用无效或效果不理想的原因，考察药物在不同剂型中的溶出差异性等都有很重要的研究意义。实验过程中应注意实验前应预热、保温，并保证溶出杯外部水浴高度超过溶出杯中液面高度，以保证整个实验过程温度的恒定。溶出介质应脱气处理，以防止其中气体影响药物的释放等细节。

后期实验在选择指标成分时，应选择内外指标共同跟踪研究的方法。选择依据可以按传统中医药理论，更倾向于选择与功能主治相吻合的有效成分、毒性药物的有效成分等进行体内外评价研究。