穿心莲内酯通过调控miR-206/STC2抑制前列腺癌细胞增殖并诱导凋亡的机制

郝丹 岳磊 黄金明

(南阳医学高等专科学校第一附属医院泌尿外科，河南 南阳 473000)

前列腺癌是第二大男性恶性肿瘤，据统计，2012年世界前列腺癌新发病例约109万，死亡例数约30万，其中北美、西欧等发达地区发病率较高，中非、东南亚等欠发达地区发病率较低，总体呈上升趋势〔1〕。随着人口老龄化进程和饮食结构的改变，我国前列腺癌发病率和死亡率已分别占男性恶性肿瘤第6位和第9位〔2〕。前列腺癌的发生与年龄、居住地区、饮食结构、遗传等多种因素有关，采用直肠指检、前列腺特异性抗原检测、磁共振成像等进行临床筛查及外科手术、放化疗、姑息治疗、中药治疗等综合治疗方式有助于改善患者预后、延长患者总生存期〔3～5〕。传统中草药治疗在肝癌、胃癌等多种肿瘤的治疗中发挥良好的抗肿瘤作用〔6，7〕。穿心莲内酯是中药穿心莲的有效成分之一，具有抗菌消炎、保肝利胆、抗肿瘤等药理作用，能够通过调节细胞周期蛋白表达调节细胞周期，抑制多种癌细胞的体外增殖〔8〕。本研究以PC-3人前列腺癌细胞为研究对象，检测穿心莲内酯对细胞增殖、凋亡及细胞中miR-206表达的影响。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2015年8月至2018年3月就诊于南阳医学高等专科学校第一附属医院经病理科确诊为前列腺癌的患者45例为研究对象，年龄43～81岁；经手术切除的前列腺癌组织样本及相应的癌旁组织(距离病灶≥5 cm)迅速放入液氮中，带回后于-80℃ 冰箱保存；所有患者术前未接受放疗或化疗并签署知情同意书；本实验经医学伦理委员会审批同意。

1.2材料 PC-3细胞(批号：CRL-1435)购自ATCC；穿心莲内酯(批号：100136-201405)购自中国药品与生物制品鉴定所；胎牛血清(批号：SH41288)、RPMI1640培养液(批号：SH30807)购自美国Gibco-BRL公司；噻唑蓝(MTT，批号：M2129)购自美国Sigma公司；膜联蛋白(Annexin)V-FITC凋亡检测试剂盒(批号：170207)购自美国Coulter公司；Lipofectamine 2000转染试剂(批号：11668027)购自美国Invitrogen公司；二甲基亚砜(DMSO)(批号：D8370)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(批号：BSP0161)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(批号：D0010)、电化学发光(ECL)液(批号：PE0030)、结晶紫(批号：C8470)、4% 多聚甲醛(批号：P1110)、RIPA裂解液(批号：R0020)购自北京Solarbio公司；免疫组化试剂盒(批号：1410319706)购自迈新生物技术有限公司；miR-206模拟物及抑制物购自美国Invitrogen公司；斯钙素(STC)2多克隆抗体(批号：ABP60538)购自武汉艾美捷科技有限公司；GAPDH多克隆抗体(批号：XFC1665)购自上海信帆生物科技有限公司；TaKaRa反转录试剂盒(批号：RR047A)、TaKaRa实时荧光定量试剂盒(批号：RR820A)购自宝生物工程(大连)有限公司；MCO-18AC型CO2培养箱购自日本SANYO公司；NanoDrop微量核酸测定仪购自上海创萌生物科技有限公司；流式细胞仪购自美国BD公司；酶标仪购自Thermo公司；ABI-7300实时荧光定量PCR仪购自上海普迪生物技术有限公司。

1.3细胞培养与分组 使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养PC-3细胞，每天更换新鲜培养液。取生长对数期的PC-3细胞，胰酶消化后重悬，调整细胞悬液浓度为1×105个/ml并接种于96孔板。细胞分组：常规培养24 h后更换新鲜培养液，实验组细胞加入穿心莲内酯并调整浓度为10 μmol/L，记为穿心莲内酯组；取等量DMSO加入到培养液中，记为对照组；汇合度约45% 的PC-3细胞按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行转染，分别将模拟物对照、miR-206模拟物、抑制物对照、miR-206抑制物转染至PC-3细胞并分别标记为miR-NC组、miR-206组、miR-con组、miR-206抑制物组；穿心莲内酯+miR-con组：转染抑制物对照后的PC-3细胞培养液中加入穿心莲内酯并调整浓度为10 μmol/L；穿心莲内酯+miR-206抑制物组：转染miR-206抑制物后的PC-3细胞培养液中加入穿心莲内酯并调整浓度为10 μmol/L；每组细胞6个复孔，实验重复3次。

1.4MTT法检测细胞增殖 对照组、穿心莲内酯组、miR-NC组、miR-206组、穿心莲内酯+miR-con组和穿心莲内酯+miR-206抑制物组细胞在37℃、5% CO2条件下常规培养，分别在培养24 h、48 h、72 h时加入20 μl MTT(5 mg/ml)，继续孵育4 h；弃去多余培养基后加入150 μl DMSO振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处吸光度(A)值。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡 取各组细胞，胰酶消化后4℃、900 r/min离心10 min收集。按照Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒说明书分别加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，轻轻混匀后室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6qRT-PCR 取适量前列腺癌组织及癌旁组织细胞充分研磨，加入Trizol试剂提取总RNA，使用超微量核酸蛋白测定仪检测RNA浓度和纯度。分别使用TaKaRa反转录试剂盒和荧光定量试剂盒将RNA反转录为cDNA并配制反应体系，以GAPDH为内参进行PCR扩增，采用F=2-△△Ct法分析miR-206和STC2相对表达量，每个RNA样品重复3次。MiR-206引物：上游：5′-AGTTCACCTTGATGCCGTTCT-3′，下游：5′-CAGTGCTTCAGCCGCTACCC-3′；STC2引物：上游：5′-ATGCTACCTCAAGCACGACC-3′，下游：5′-TCTGCTCACACTGAACCTGC-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物：上游5′-GCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGG-3′，下游：5′-GCCTGCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3′。

1.7Western印迹 将各组细胞超声粉碎，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液于冰上裂解5 min，4℃，36 000 r/min离心15 min，收集上清。取蛋白样品进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，结束后将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂奶粉磷酸盐吐温缓冲液(PBST)封闭2 h。分别加入兔抗人STC2多克隆抗体(1∶100)、兔抗人GAPDH多克隆抗体(1∶1 000)，4℃ 孵育过夜，TBST漂洗后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育2 h。TBST漂洗3次，每次10 min，ECL试剂盒发光显影，每个样品重复3次。

1.8免疫组化 收集的前列腺癌组织及癌旁组织经10%甲醛固定，石蜡包埋后4 μm连续切片，使用二甲苯和梯度乙醇溶液脱蜡水化，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次。滴加3 % 过氧化氢室温孵育10 min，阻断过氧化物酶，将切片浸入0.01 mol/L柠檬酸缓冲液微波加热至沸腾30 min，自然冷却至室温，先后用蒸馏水和PBS洗涤；加入PBS稀释的正常山羊血清37℃ 封闭30 min。按照免疫组化试剂盒说明书加入STC2单克隆抗体(1∶100)，湿盒中4℃孵育过夜；加入生物素标记的二抗37℃ 孵育25 min；PBS洗涤3次，每次3 min。二氨基联苯胺(DAB)避光显色，苏木素复染；经梯度乙醇和二甲苯脱水透明后中性树胶封片；显微镜下观察。

1.9双荧光素酶报告基因实验 取生长对数期的PC-3细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书将STC2 3′UTR野生型(WT)质粒和突变型(MUT)质粒分别与模拟物对照或miR-206模拟物共转染，常规培养48 h。加入细胞裂解液裂解后4℃，36 000 r/min离心10 min收集上清，检测荧光素酶活性。

1.10统计学分析 使用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1穿心莲内酯对PC-3细胞增殖、凋亡及miR-206表达的影响 穿心莲内酯组培养48 h、72 h的细胞活性较对照组均显著降低(P<0.05)；而细胞凋亡率及细胞中miR-206表达水平则显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2过表达miR-206对PC-3细胞增殖和凋亡的影响 与miR-NC组比较，miR-206组细胞中miR-206表达水平显著升高(P<0.05)；48 h、72 h时细胞活性显著低于miR-NC组(P<0.05)，而细胞凋亡率较miR-NC组显著升高(P<0.05)。见表2。

2.3抑制miR-206表达可逆转穿心莲内酯对PC-3细胞增殖的抑制及凋亡的诱导作用 穿心莲内酯干预PC-3细胞，细胞中miR-206表达显著上调(P<0.05)，48 h、72 h细胞活性显著下降(P<0.05)，凋亡细胞数显著增加(P<0.05)；而将miR-206抑制物转染至PC-3细胞并联合穿心莲内酯干预后，细胞中miR-206表达水平、细胞活性及凋亡率均基本恢复至正常水平(P<0.05)。见表3。

2.4前列腺癌组织中miR-206和STC2表达 STC2在前列腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织(6.76±0.62 vs 1.03±0.19,P<0.05)，见图1。与癌旁组织比较，前列腺癌组织中miR-206表达显著下调(1.21±0.12 vs 0.35±0.07,P<0.001)。

表1 穿心莲内酯对PC-3细胞增殖、凋亡及miR-206表达的影响

表2 miR-206过表达对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响

表3 抑制miR-206表达可逆转穿心莲内酯对PC-3细胞增殖的抑制及凋亡的诱导作用

与对照组比较：1)P<0.05；与穿心莲内酯+miR-Con组比较：2)P<0.05；表5同

图1 STC2在前列腺癌组织及癌旁组织中的表达(×200)

2.5miR-206靶向调控STC2表达 Targetscan在线预测发现，STC2 3′UTR上存在miR-206的结合位点(图2)；与miR-NC组比较，miR-206组WT-STC2细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，而MUT-STC2荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。见表4。

图2 STC2的3′UTR中含有与miR-206互补的核苷酸序列

组别WT-STC2 MUT-STC2miR-NC组1.43±0.131.47±0.14miR-206组0.67±0.081.44±0.15t值8.6240.253P值0.0010.813

2.6抑制miR-206表达对穿心莲内酯处理的PC-3细胞中STC2表达的影响 穿心莲内酯干预PC-3细胞后，细胞中STC2 mRNA和蛋白水平的表达均显著下调(P<0.05)；而将miR-206抑制物转染至PC-3细胞进行预处理后，细胞中STC2表达水平基本恢复至正常水平(P<0.05)。见图3、表5。

1～4：对照组、穿心莲内酯组、穿心链内酯+miR-Con组、穿心莲内酯+miR-206抑制物组图3 前列腺癌细胞中STC2蛋白表达

组别STC2 mRNASTC2蛋白对照组1.46±0.150.76±0.08穿心莲内酯组0.67±0.071)0.23±0.031)穿心莲内酯+miR-Con组0.62±0.060.19±0.02穿心莲内酯+miR-206抑制物组1.33±0.132)0.71±0.072)F/P值47.783/0.00088.151/0.000

3 讨 论

穿心莲又名一见喜、苦草，是爵床科穿心莲属1年生草本植物，广泛分布于我国广东、广西、海南等地；其化学成分包括黄酮类、生物碱、三萜类、二萜内酯类等，常用于肠胃炎、呼吸道感染、感冒发热等疾病的治疗〔9〕。近年来，穿心莲内酯在肿瘤领域的研究受到了广泛关注，其抗肿瘤作用在越来越多的研究中得到证实。如：Chen等〔10〕研究发现，穿心莲内酯能够通过诱导肝癌细胞凋亡发挥抗肿瘤作用；Chao等〔11〕研究发现，在结肠癌细胞中，穿心莲内酯可抑制基质金属蛋白酶2活性，从而抑制细胞侵袭。此外，在前列腺癌的相关研究中，已有报道〔12〕称：穿心莲内酯可调控细胞周期、降低细胞活力及迁移能力。本文检测发现，经10 μmol/L穿心莲内酯干预的PC-3细胞活性降低，同时细胞凋亡率增加。

微小RNA(miRNA)是普遍存在于真核细胞内的内源性非编码RNA分子，参与调节细胞生长、分化、胚胎发育、免疫应答等生物过程，与多种人类疾病的发生发展有关〔13〕。多项研究〔14，15〕表明，miRNA分子在肿瘤组织中异常表达，能够调节细胞周期蛋白、凋亡相关蛋白、基质金属蛋白酶等多个靶基因表达，调控癌细胞的增殖、凋亡和转移，在肿瘤进程中起促进或抑制作用。miR-206是一种脊椎动物特有的miRNA分子，定位于人6号染色体、小鼠1号染色体，不同物种间的miR-206序列存在高度保守性〔16〕；在胃癌、肺癌等多种肿瘤组织中呈低表达，能够靶向调节细胞周期素D2、c-Met、蛋白激酶B等基因表达，阻滞细胞周期，抑制细胞增殖、迁移和侵袭及血管生成，其表达水平与患者预后及总体生存率存在显著的相关性〔17～19〕。在前列腺癌中，已有证据〔20〕表明，miR-206可通过调节钙黏蛋白和波形蛋白表达，抑制细胞侵袭和转移。本研究采用qRT-PCR实验检测发现，miR-206在前列腺癌组织中低表达，穿心莲内酯干预可促进PC-3细胞中miR-206表达。在PC-3细胞中过表达miR-206能够降低细胞活性并诱导细胞凋亡；抑制miR-206表达可逆转穿心莲内酯对细胞活性的抑制及凋亡的促进作用。通过Targetscan在线预测和双荧光素酶报告基因实验验证表明，STC2是miR-206的靶基因。

STC是一种糖蛋白激素，首次发现于硬骨鱼中，以自分泌和旁分泌的方式参与机体生理功能，根据氨基酸序列差异可分为STC1和STC2〔21〕。STC2含302个氨基酸残基，定位于染色体5q35，在多种哺乳动物组织中均有表达。据报道〔22，23〕，STC2在肾细胞癌、结直肠癌等多种人类肿瘤组织中高表达，且STC2高表达的患者总体生存率低于STC2低表达的患者，其表达水平与淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分期相关。Miyazaki等〔24〕研究发现，敲除STC2能够显著抑制低氧条件下的结直肠癌细胞生长和迁移；Wang等〔25〕研究发现，STC2能够调节细胞周期蛋白D1表达，促进肝细胞癌细胞增殖和迁移，起癌蛋白的作用。在前列腺癌中，已有证据〔26〕表明：STC2在前列腺癌组织中高表达，采用RNAi技术沉默STC2能够抑制前列腺癌细胞的生长；反之，过表达STC2则显著促进细胞生长。本实验采用免疫组化法检测前列腺癌组织中STC2表达发现，对比癌旁组织，前列腺癌组织中STC2表达显著升高，与上述结论〔26〕一致；穿心莲内酯能够上调PC-3细胞中STC2 mRNA和蛋白表达，将miR-206抑制物转染至PC-3细胞则逆转穿心莲内酯对STC2表达的促进作用。

综上所述，在前列腺癌组织中miR-206低表达而STC2高表达，穿心莲内酯能够通过上调miR-206水平靶向抑制STC2表达，从而抑制PC-3细胞增殖并诱导细胞凋亡；这一研究结果为穿心莲内酯在前列腺癌中的深入研究提供实验基础。