猪流行性腹泻病毒安徽分离株N基因的克隆与表达

潘孝成　沈学怀　赵瑞宏　戴银　胡晓苗　侯宏艳　周学利　张丹俊

摘要 [目的]克隆和表达猪流行性腹泻病毒（PEDV）的N基因。[方法]采用RT-PCR方法对PEDV FD株的N基因进行扩增，将扩增产物连接pET-28B载体，阳性质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞，诱导表达目的蛋白。[结果]PEDV FD株N基因序列全长为1 326个核苷酸，编码441个氨基酸;重组N蛋白为可溶性表达，大小约58 ku;Western blot检测结果表明，重组N蛋白与PEDV抗体阳性血清发生特异性反应。[结论]该试验制备的PEDV重组N蛋白具有较好的免疫原性，可用于PEDV诊断方法的开发及相关研究。

关键词 猪流行性腹泻病毒;N蛋白;原核表达

中图分类号 S852.65 +7文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）17-0091-03

Abstract [Objective] To clone and express the N gene of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）. [Method] N gene of PEDV FD strain was amplified by RTPCR and clone into pET28B vector， the positive plasmid was transformed into BL21 competent cell of Escherichia coli to  express N protein under IPTG induction. [Result]  N gene of PEDV FD strain contained 1 326 nucleotides in whole length， encoding 441 amino acids. The expressed recombinant N protein was soluble and it was about 58 ku. Westernblot detection results showed that the N protein and PEDV positive sera reacted specifically. [Conclusion] The recombinant N protein of PEDV had a good immunogenicity，which could be used for the  diagnosis method development and research of PEDV.

Key words Porcine epidemic diarrhea virus;N protein;Prokaryotic expression

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一种以腹泻、脱水和呕吐为特征的传染病，尤其以哺乳仔猪受害最严重，发病率可达100%，平均病死率为50%，10日龄内哺乳仔猪死亡率可高达90%，成年猪一般无死亡[1]。PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属，为有囊膜的、不分节段的、单股正链RNA病毒，基因组全长约28 kb，编码有纤突（spike，S）蛋白、小膜（small envelope，E） 蛋白、膜（membrane，M） 蛋白和核衣壳（nucleocapsid，N） 蛋白4种主要结构蛋白[2]。PEDV 的N蛋白由441个氨基酸组成，主要参与病毒的复制以及诱导特异性免疫反应的产生，而且在PEDV感染早期宿主能够产生针对N蛋白的高水平抗体，因而利用N蛋白建立PEDV诊断技术具有很好的应用前景[3-6]。笔者对PEDV FD株的N基因进行克隆，原核表达并纯化其N蛋白，旨在为进一步建立PEDV的诊断方法提供基础和依据。

1 材料与方法

1.1 病毒

PEDV FD株从安徽省肥东县某发生猪流行性腹泻病猪场的仔猪小肠黏膜中分离，由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所兽医研究室鉴定和保存。

1.2 主要试剂与菌株

RNAiso Plus试剂、反转录试剂盒（M-MLV）、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、IPTG 和X-gal、pET-28B载体等均购自TaKaRa公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、DNA Marker、蛋白Marker等購自生工生物工程（上海）股份有限公司;其他常用试剂均为进口或国产分析纯。

1.3 PEDV N基因的扩增

1.3.1 引物合成。

根据GenBank数据库已发表的PEDV N基因序列，设计了1对引物，P1（NdeI酶切位点）为5′-CTAGCTAGCATGGCTTCTGTCAGCTTTCAGG-3′，P2（XhoI酶切位点）：5′-CCGCTCGAGCCTGTATCGAAGATCTCGTTG-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，扩增1 326 bp基因片段，包含PEDV N基因全长。

1.3.2 RNA提取及cDNA合成。

PEDV FD株细胞培养液200 μL，按TaKaRa公司RNAiso Plus试剂盒说明书提取总RNA，使用TaKaRa公司1st Strand cDNA合成试剂盒进行反转录，合成cDNA，-20 ℃下保存备用。

1.3.3 PCR扩增和测序。

以合成的cDNA为模板，利用引物对P1/P2进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：cDNA 3 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL、上下游引物各1 μL（10 pmol/μL）、Ex-Taq酶0.5 μL、ddH2O 15 μL;PCR扩增程序如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，50 ℃ 50 s，72 ℃ 1.5 min，31个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。电泳鉴定为阳性的PCR产物，使用NdeI和XhoI酶切回收PCR产物，将酶切产物连接pET-28B载体，转入DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行培养后提取重组质粒，进行酶切鉴定，将阳性克隆送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4 PEDV N基因的原核表达

1.4.1 重组质粒的诱导表达。

将阳性质粒转入E.coli BL21（DE3）感受态细胞，涂布于含50 μg/ mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃下振荡培养过夜。挑取单克隆菌落接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃220 r/min，培养至 OD600为0.4～0.6，加入 IPTG使终浓度为0.5 mmol/L，15 ℃ 160～170 r/min，继续培养24 h。

收集经IPTG诱导后的菌液和未经IPTG诱导的菌液各1 mL，10 000 r/min 4 ℃高速离心2 min，弃去上清液，加入50 μL PBS后轻轻摇晃离心管，重悬管内沉淀，并加入50 μL 2×蛋白电泳Loading Buffer，在冰浴中用超声波裂解菌体。将超声波裂解后的液体加入相同体积的 5×上样缓冲液，混合均匀后沸水煮浴10 min，经12 000 r/min 4 ℃高速离心2 min，取10 μL样品进行SDSPAGE电泳分析。

1.4.2 蛋白表达形式分析及纯化。

将经IPTG诱导表达后的菌液超声波裂解，经12 000 r/min 4 ℃高速离心2 min后，分别收集上清和沉淀，并将收集到的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳。大量诱导菌液500 mL，经超声波裂解后收集上清，参照蛋白纯化说明书操作步骤对收集的上清过镍柱纯化。

1.4.3 重组蛋白的 Western blot检测分析。

蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜封闭后，用含5%脱脂奶粉的PBST作为转膜封闭液，4 ℃封闭过夜;将封闭好的NC膜侵泡入200 倍稀释的PEDV阳性血清，37 ℃孵育1 h;用PBST充分洗涤NC膜，然后浸入用PBST 5 000倍稀释的羊抗猪IgG-HRP中，37 ℃孵育1 h;PBST充分洗涤后，加入AEC显色10 min，ddH2O冲洗终止反应。

2 结果与分析

2.1 PEDV N基因的扩增和测序

以提取的RNA为模板，合成cDNA，用合成的cDNA和引物对P1/P2进行PCR扩增。电泳结果显示，扩增的基因片段大小约1 300 bp（图1），与预期结果相符。测序结果表明，PEDV FD株N基因序列全长为1 326个核苷酸，编码441个氨基酸。

2.2 表达产物的SDS-PAGE鉴定

将收集的诱导后菌液和未诱导的菌液处理后进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图2所示，经IPTG诱导后的菌液有一条大约58 ku的蛋白条带，与目标条带相符，而未经诱导的重组菌未见相应蛋白条带。

2.3 重组蛋白的表达分析和纯化

将经过IPTG诱导表达后的菌液超声波裂解，12 000 r/min 4 ℃高速离心2 min后，分别收集上清液和沉淀，并将收集到的上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳，可以看出上清液和沉淀均有一条分子量58 ku左右的条带，且目的蛋白主要在上清液中，表明重组蛋白为可溶性表达;经镍柱纯化，获得单一目的条带，具体见图3。

2.4 重组蛋白的Western blot检测结果

将过镍柱纯化后的重组N蛋白经Western blot分析，结果显示在58 ku处出现清晰的反应条带，而阴性对照无反应条带，表明重组N蛋白与PEDV抗体阳性血清发生特异性反应（图4）。

3 讨论

猪流行性腹泻病于1971年首次发现于英国[7]，我国内地自20世纪80年代初以来陆续有关于PEDV分离和鉴定的报道[8]。从2010年末开始，我国东南沿海地区率先暴发以新生仔猪严重腹泻、高发病率及高死亡率为主要特征的腹泻疫情，哺乳仔猪的死亡率可达100%，疫情随后扩散至其他各地，给我国养猪业造成了严重的经济损失[9]。2013年美国也开始暴发仔猪腹泻疫情，随后墨西哥、加拿大、韩国以及日本等国家和我国台湾地区[10]也相继暴发具有新流行特点的仔猪腹泻疫情。研究表明，此次全球范围内PED暴发与PEDV的新变异毒株有关[11-12]。目前，猪流行性腹泻病的发生在我国呈現常态化[13]，是威胁养猪生产的重要疫病之一，需要给予高度关注。

猪流行性腹泻病毒的N蛋白由441个氨基酸组成，分子量大小为55～58 ku，在同属病毒之间的同源性较低，但在同种病毒间具有高度保守性，主要参与病毒的复制以及诱导特异性免疫反应的产生，可作为早期快速检测PEDV感染的一个重要指标[3]。该研究对PEDV FD株的N基因进行了克隆与原核表达，结果显示重组N蛋白为可溶性表达;Western blot检测结果表明，纯化重组N蛋白与PEDV抗体阳性血清发生特异性反应，表明PEDV重组N蛋白具有较好的免疫原性。该研究结果为开发PED诊断方法和相关研究奠定了基础。

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