血清COL4A3蛋白与非小细胞肺癌(NSCLC)患者临床病理特征及预后的相关性

胡安邦 李卫青 洪国岱 苏 琳 邹纯朴 陈 晓 焦肖宁 朱杨壮壮 胥孜杭

(1上海中医药大学深圳医院-深圳市罗湖区中医院呼吸病科 深圳 518001; 2深圳市罗湖区人民医院中医科,3肿瘤科 深圳 518001; 4上海中医药大学基础医学院内经教研室 上海 201203)

近年的流行病学统计结果显示,无论是在发达国家还是在发展中国家的发达地区,肺癌已成为发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1-2],其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常见的类型,约占80%～85%[3]。肺癌起病隐匿,难以早期诊断,往往确诊时已处于晚期,5年生存率极低。除了常规的手术、放疗、化疗以外,分子靶向治疗越来越受到关注。

Ⅳ型胶原蛋白α3(collagen type Ⅳ alpha 3,COL4A3)属于Ⅳ型胶原蛋白家族,该基因与肾脏疾病和多种肿瘤密切相关。COL4A3基因位于人染色体2q36-q37上,含有52个外显子,编码产物为8 114 bp的mRNA和162 000的蛋白质[4]。COL4A3的分布仅限于具有组织特异性的基底膜,如肾小球基底膜、耳蜗基底膜、前晶状体囊的眼基底膜、Descemet膜、卵巢和睾丸基底膜,以及肺泡毛细血管基底膜[5]。2000年,人类COL4A3的NC1结构域被制成重组蛋白,命名为“tumstatin”,可抑制毛细血管内皮细胞的增殖和血管形成,并诱导内皮细胞特异性凋亡[6],还可抑制小鼠异种移植模型中人肾细胞癌和前列腺癌的生长[7]。Ⅳ型胶原蛋白具有细胞黏附功能,参与乳腺癌[8]、胃癌[9]、肺癌[10]、急性骨髓性白血病、胰腺导管腺癌、卵巢癌[11]、肝癌[12]、膀胱癌[13]等多种不同肿瘤的侵袭和转移。在肾脏肿瘤中,COL4A3基因持续高表达可诱导间充质干细胞参与肿瘤基质重塑,加速肿瘤发展进程。在分化良好的肺肿瘤中,其肿瘤簇周围也可检测到COL4A3高表达[14]。本研究旨在探讨血清COL4A3蛋白表达与NSCLC患者临床病理及预后的相关性,其对NSCLC细胞生长、侵袭及转移的作用,可否作为NSCLC患者预后不良的独立标志物,以期为肺癌精准治疗提供依据。

资料和方法

研究对象收集2005年至2017年就诊于深圳市罗湖区人民医院和罗湖区中医院的NSCLC患者,共计90例,其中男性60例,女性30例,年龄31～86岁,平均55岁。纳入标准:(1)符合美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN) NSCLC治疗指南(2017年第2版)中的诊断标准,以及肿瘤-淋巴结-转移(tumor-node-metastasis,TNM)分期;(2)至少有1个明确可测量的病灶(10 mm);(3) Karnofsky (KPS)≥60分,预计生存期≥3个月;(4)受试者签署知情同意书。排除标准:不符合上述纳入标准的肺癌患者;妊娠期或哺乳期患者;合并有心血管、肾和造血、免疫系统等严重原发性疾病、精神病等影响疗效与安全性判断的患者;失访病例。另择58名健康人作为对照组。

标本采集与检测采集患者空腹晨血3 mL,离心后使用COL4A3 ELISA试剂盒(美国Aviva Systems Biology公司),参照说明书进行检测。

细胞培养A549细胞购自中国科学院上海细胞库,采用DMEM培养基(美国Gibco公司),含有100 U/mL青霉素-链霉素(美国Hyclone公司)和10%胎牛血清(美国Gibco公司),在37 ℃、5%CO2中培养。

MTT法检测细胞增殖将A549细胞消化后以3 000个/孔的密度接种于96孔板。贴壁过夜后吸去原有培养液,加入含不同浓度COL4A3 (5和10 μg/mL)的完全培养液。分别在干预1、3、5、7天后加入MTT试剂。置于37 ℃孵育4 h,弃去上清,每孔加入150 μL二甲亚砜(DMSO)溶解甲瓒颗粒,使用酶标仪检测490 nm处吸光度(D)。

Transwell实验使用8 μm Transwell过滤器(美国BD公司)测定纤维蛋白原(美国Sigma公司)对细胞迁移和侵袭的影响。将含/不含Matrigel(美国BD公司)涂布的膜放置于上室,然后将0.5 μL无血清DMEM培养基中的A549细胞(3×104)加入其中。对处理组COL4A3(5和10 μg/mL)进行相同操作。下室填充500 μL含有10%胎牛血清的基础培养基。在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h后,迁移至下部隔室的细胞用甲醇固定,并用结晶紫染色。在每孔随机选择的区域内以100×放大率进行成像和细胞计数。

克隆形成实验A549细胞消化后以500个/孔接种于6孔板。贴壁过夜后吸去培养液,加入含不同浓度COL4A3(5和10 μg/mL)的完全培养液。培养7天后,使用4%多聚甲醛室温固定30 min,加入结晶紫染料染色20 min。清洗后于倒置显微镜下观察克隆形成数目,并拍摄显微成像图像。

统计学处理使用SPSS 20.0软件统计分析数据,Mann-Whitney U检验统计分析血清COL4A3水平与患者临床病理特征的关系,Kaplan-Meier分析血清COL4A3水平与患者生存期的关系,ROC曲线分析血清COL4A3水平预测NSCLC患者肿瘤转移的敏感性与特异性。P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有显著统计学意义。

结 果

血清COL4A3水平与NSCLC患者临床病理特征的关系90名NSCLC患者的血清COL4A3水平为(4.21±1.14) μg/L。对照组血清COL4A3水平为(2.75±0.64) μg/L,患者与健康人的血清COL4A3水平差异有显著统计学意义(P<0.001)。评估NSCLC患者的临床病理特征:性别、年龄、吸烟、组织学类型、肿瘤大小、病理分级、淋巴转移、癌症阶段及血清COL4A3水平。血清COL4A3水平与临床病理参数的相关性参见表1,其中性别、年龄、吸烟、肿瘤大小、病理分级、淋巴转移及临床分期的比较采用独立样本t检验,而组织学类型的比较采用单向ANOVA检验。血清COL4A3水平与NSCLC患者的性别、年龄、吸烟、肿瘤大小、病理分级及组织学类型均无关;而与淋巴结转移(P=0.002)和临床分期(P=0.001)相关。

表1 NSCLC患者凝血变量与临床病理特征的相关性Tab 1 Correlation between coagulation variables and clinicopathological characteristics in NSCLC patients

血清COL4A3 预测NSCLC患者肿瘤转移及其对生存时间的影响从NSCLC患者血清COL4A3的ROC曲线分析中的最佳截断值预测患者肿瘤转移的敏感性(图1)。当血清COL4A3为4.13 μg/L时,敏感性为76.2%,特异性为65.4%,AUC为0.731 (P<0.001,95%CI:0.673～0.837),对患者临床分期具有潜在的预测价值(图1A)。在90例NSCLC患者中,中位血清COL4A3水平为4.13 μg/L,COL4A3高表达与COL4A3低表达的患者相比,生存期差异有统计学意义(P=0.021),低表达患者的存活时间更长(图1B)。

单/多因素分析CO1L4A3与肺癌预后相关的因素单因素分析结果显示,患者OS与肿瘤大小、病理组织分级、淋巴结转移、临床分期以及血清COL4A3水平密切相关;多因素分析结果显示,患者淋巴结转移情况、临床分期以及血清COL4A3水平与肺癌预后密切相关(P<0.05,表2)。提示血清COL4A3水平可能是肺癌患者OS的独立预测因子。

A:Clinical stage was predicted by ROC curve analysis of serum COL4A3 in patients with NSCLC,and the optimal cutoff value of COL4A3 concentration was 4.13 μg/L.B:OS of 90 patients was showed by Kaplan-Meier curve (P=0.021).
图1 血清COL4A3的ROC分析预测临床分期及其对生存期的影响
Fig 1 ROC analysis of serum COL4A3 predicted clinical stage and its effect on overall survival

表2 单因素和多因素分析预测NSCLC患者预后情况Tab 2 Univariate and multivariate analysis of prognostic valuables for overall survival

COL4A3促进NSCLC细胞增殖和转移血清COL4A3高表达与NSCLC患者不良预后的相关性较强。用MTT实验检测人NSCLC细胞株A549的增殖情况,发现低浓度COL4A3(5 μg/mL)可促进细胞增殖,高浓度COL4A3(10 μg/mL)促进细胞增殖的作用更强(图2A)。克隆形成实验结果显示,COL4A3对A549细胞增殖的促进作用呈浓度依赖性,即浓度越高促进作用越明显(图2B)。Transwell实验发现,COL4A3对A549细胞转移的抑制作用有明显的浓度依赖趋势(图2C)。

讨 论

COL4A3基因高表达与多种疾病相关,如Alport综合征、节段性肾小球硬化、2型糖尿病、高原红细胞增多症及阿尔兹海默症等,其也是多种肿瘤发生发展的风险基因[15-17]。COL4A3属于Ⅳ型胶原蛋白家族成员,Ⅳ型胶原蛋白在细胞外基质-基底膜(basal membrane,BM)的形成和维持中发挥重要作用,是构成BM的主要成分和骨架。当肿瘤细胞发生转移时必须穿透上皮细胞BM以及围绕血管的BM,故肿瘤细胞分泌的Ⅳ型胶原蛋白酶可溶解Ⅳ型胶原蛋白,是肿瘤细胞侵袭和转移的重要环节[18]。COL4A3作为Ⅳ型胶原蛋白家族成员,其过度表达被认为与多种恶性肿瘤的转移、侵袭密切相关[19-20]。在肾癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤患者血清中可检测出COL4A3高表达,其与肿瘤大小、淋巴管侵袭、静脉侵袭和TNM分期等肿瘤进展的指标呈现正相关[21-23]。在使用顺铂和吉西他滨化疗的NSCLC患者中,COL4A3低表达患者的中位OS明显高于COL4A3高表达患者[24]。但是COL4A3影响NSCLC肿瘤进程的具体机制目前尚无报道,其可否成为NSCLC的诊断标志物有待进一步研究。

本研究临床数据显示健康人与NSCLC患者血清COL4A3存在显著差异,NSCLC患者血清COL4A3表达水平明显增高,高表达组(>4.13 μg/L)的OS明显低于低表达组(<4.13 μg/L)(P<0.05)。在NSCLC患者的临床病理特征中,淋巴结转移和临床分期都与COL4A3表达密切相关:淋巴结转移患者血清COL4A3水平明显高于无转移患者(P<0.05),临床分期Ⅰ、Ⅱ期患者血清COL4A3水平明显低于Ⅲ、Ⅳ期患者(P<0.05)。说明COL4A3的表达水平与NSCLC患者肿瘤进展程度呈正相关。单、多因素分析NSCLC预后相关因素的结果发现,COL4A3水平与NSCLC预后密切相关,提示血清COL4A3高表达的NSCLC患者可能预后不良。COL4A3高表达可加快NSCLC发展进程。实验室研究发现,COL4A3可明显促进NSCLC细胞生长、增殖,并呈浓度依赖趋势;COL4A3可明显提高NSCLC细胞的侵袭性,增强其转移能力,具有浓度依赖倾向,初步揭示COL4A3高表达可促进NSCLC细胞增殖、侵袭转移。

虽然COL4A3基因在Alport综合征等疾病中报道颇多,但其在肿瘤尤其在肺癌中的报道并不深入。目前肺癌治疗仍以铂类化疗药为主[25],因其严重的不良反应和耐药性成为提高疗效的瓶颈,肿瘤的精准疗法已成为研究热点[26-27]。血清COL4A3水平与NSCLC进展密切相关,可能是一种NSCLC患者预后不良的独立标志物。COL4A3能显著促进肺癌细胞的增殖和转移,有望成为NSCLC治疗的新靶点,其具体的分子作用机制有待进一步明确。