高效液相色谱法测定人血清中拉莫三嗪血药浓度的方法及拉莫三嗪个体化用药分析

李萌，庄星星，倪受东，何勇

拉莫三嗪（lamotrigine）是新一代苯三嗪类的广谱抗癫痫药，具有良好的抗癫痫作用，对部分性发作和全身性发作性癫痫均有治疗作用。临床上LTG联合丙戊酸为常见抗癫痫的治疗方案。此外，临床上拉莫三嗪已被作为心境稳定剂运用到双相情感障碍以及躁狂的治疗［1-2］。文献资料及临床试验表明，拉莫三嗪在体内的药代动力学过程复杂，达到有效血药浓度所需的剂量个体差异很大，其可受年龄、体质量、服药剂量及合并用药等诸多因素的影响［3-4］，临床个体化、合理用药均要求测定拉莫三嗪的血药浓度。因此，本课题组于2017年1月至2018年1月参考国内外文献资料报道的血清中拉莫三嗪的高效液相色谱法（HPLC）测定方法［5-7］，摸索、建立了一种新的简便、快速、准确的拉莫三嗪血药浓度监测方法，并将其推向临床应用，对临床病人进行拉莫三嗪血药浓度监测，为临床个体化、合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1仪器高效液相色谱仪（美国Aglient公司，型号1260）；OpenLAB CDS ChemStation工作站；Sartorius电子分析天平（上海梅特勒多-托利多）；XW-80A涡旋振荡器（上海医科大学仪器厂）；TGL-16H离心机（珠海黑马仪器公司）；氮吹仪EYELA MG-2200（北京成萌伟业科技有限公司）；数显恒温水浴锅（金坛市科析仪器有限公司，型号HH501）。

1.2试剂拉莫三嗪对照品（Sigma公司，批号L20170653）；艾司唑仑对照品（中国药品生物制品检定所，批号2016093）；甲醇（色谱纯）；二氯甲烷（分析纯）；健康人空白血清（供质控用，-20℃保存）；超纯水；其余化学试剂为分析纯；

1.3色谱条件流动相：甲醇∶水=75∶25；流速：1.0 mL/min；色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长：225 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；进样时间：8 min（出峰时间：拉莫三嗪为3.46 min；内标为4.84 min）。

1.4对照品及内标液的制备精密称取拉莫三嗪对照品1.0 mg，加入10 mL容量瓶中，定容。配制成100 μg/mL的拉莫三嗪标准液。

精密称取艾司唑仑对照品1.5 mg，加入10 mL容量瓶中，定容。配制成150 μg/mL的艾司唑仑标准液作为内标液。

1.5血清样品的处理将血样放入离心机3 000 r/min离心10 min；取血清100 μL与2.0 mL的离心管内，加内标液10 μL，振荡混匀1 min；加入二氯甲烷1.0 mL萃取，振荡1 min，取下层试液；氮气吹干，加100 μL甲醇振荡1 min复溶；5 000 r/min离心5 min；取10 μL进样。

1.6质控血清样品的制备用空白血清和拉莫三嗪标准液制备浓度分别为3.0 μg/mL，6.0 μg/mL，9.0 μg/mL，12.0 μg/mL，15.0 μg/mL以及18.0 μg/mL含拉莫三嗪的质控血清。按照“1.5血清样品的处理”进行前处理，按照“1.3色谱条件”进行分析。

2 结果

2.1专属性试验将空白血清、空白血清+内标物+拉莫三嗪对照品和病人含药血清+内标物，按“1.5血清样品的处理”方法前处理；在“1.3色谱条件”下检测。由图1可知，拉莫三嗪与内标物的色谱峰可完全分离（拉莫三嗪出峰时间：3.46 min；内标物出峰时间：4.84 min），血清中内源性物质对拉莫三嗪和内标物的出峰时间和峰面积无明显干扰，可见该检测方法专属性较高。

2.2标准曲线的建立用空白血清和拉莫三嗪标准液制备浓度分别为1.0μg/mL，3.0μg/mL，6.0μg/mL，9.0 μg/mL，12.0 μg/mL，15.0 μg/mL以及18.0 μg/mL含拉莫三嗪的质控血清。按照“1.5血清样品的处理”进行前处理，按照“1.3色谱条件”进行分析；以拉莫三嗪与内标物的峰面积比X对拉莫三嗪血药浓度Y作线性回归，得到线性回归方程：Y=9.934 4X+0.808 3，r=0.999 8（n=7）；拉莫三嗪血药浓度在1.00～18.00 μg/mL范围内线性关系良好。当信噪比：S/N≥10时，最低检测限：0.80 μg/mL。

注：a为拉莫三嗪，b为内标物

2.3精密度试验用空白血清和拉莫三嗪标准液制备浓度为9.0 μg/mL的含药血清，按“1.5血清样品的处理”方法前处理；在“1.3色谱条件”下检测。1 d内不同时间测定3次及3 d内每天进样1次，考察日内和日间精密度。结果表明日内、日间相对标准偏差（RSD）均小于15%，符合《中华人民共和国药典2015版》关于生物样品分析方法的要求。

2.4稳定性试验用空白血清和拉莫三嗪标准液制备浓度为9.0 μg/mL的含药血清，反复冻融3次后，按“1.5血清样品的处理”方法前处理；在“1.3色谱条件”下检测。结果表明3次检测结果RSD均小于15%，药物冻融稳定性良好。

2.5回收率试验用空白血清和拉莫三嗪标准液制备浓度3.0 μg/mL、9.0 μg/mL以及18 μg/mL的含药血清各3份，按“1.5血清样品的处理”方法前处理；在“1.3色谱条件”下检测，计算加样回收率；用甲醇和拉莫三嗪对照品制备浓度3.0 μg/mL、9.0 μg/mL以及18 μg/mL的工作液，进样测定。以标准血清样品中拉莫三嗪峰面积与工作液中拉莫三嗪峰面积计算提取回收率。结果见表1。

表1 拉莫三嗪加样回收率试验结果/%

2.6干扰试验取口服拉莫三嗪联合其他治疗药物（丙戊酸、奥卡西平、卡马西平、苯妥英钠、苯巴比妥）病人的血样。按“1.5血清样品的处理”方法前处理；在“1.3色谱条件”下检测。实验结果表明，联合相关药物对拉莫三嗪以及内标物的出峰时间和峰面积无影响。

2.7临床应用选择5例在安徽医科大学附属巢湖医院门诊或住院口服拉莫三嗪的病人，拉莫三嗪片均由该院提供（规格25 mg×48片/盒，湖南三金制药 生 产 ，批 号 170123，170318，170509，170624，170923），病人的情况和拉莫三嗪治疗药物监测结果见表2。

表2 拉莫三嗪治疗药物监测结果以及个体化用药分析

根据神经精神药理学与药物精神病学协会（AGNP）指南，拉莫三嗪治疗药物监测推荐范围：3～14 μg/mL。治疗药物监测可为拉莫三嗪临床合理、个体化用药提供参考依据，在药物不良反应监测以及病人服药依从性方面均可为临床提供有价值的药学服务信息。

本课题组认为，药学人员在分析血药浓度结果时，应当摆脱血药浓度推荐范围的药学思维束缚。根据血药浓度监测结果制定个体化治疗方案时，综合考虑血药浓度监测结果、临床疗效以及药物不良反应情况，在保证病人安全用药的前提下，使病人获得最大的治疗效益。

3 讨论

拉莫三嗪在体内有多种代谢途径，主要在肝脏与葡糖醛酸转移酶以及葡萄糖醛酸结合产生葡萄糖醛酸结合物，由尿液排出体外［8］。与传统的抗癫痫药物不同，拉莫三嗪的经肝代谢过程中无氧化反应，对肝药酶无诱导或抑制作用，因此拉莫三嗪对其他药物的代谢无明显影响。文献资料表明，当拉莫三嗪与肝药酶诱导剂（如卡马西平、苯巴比妥）联合使用时，血浆清除率增加1.18倍，半衰期明显缩短；当与肝药酶抑制剂（如丙戊酸）合用时，血浆清除率下降60%，半衰期明显延长［9］。因此拉莫三嗪的体内代谢过程极易受到其他药物的影响，特别是与酶诱导剂或酶抑制剂联合使用时，其相互作用复杂，对拉莫三嗪血药浓度影响较大，对使用拉莫三嗪的病人进行治疗药物监测十分必要［10］。

HPLC在监测血药浓度时，流动相的选择对待测物和内标物的峰对称性、分离情况以及保留时间等色谱行为都存在影响。课题组通过实验对比甲醇-水系统、乙腈-水系统以及乙腈-磷酸盐缓冲液；结果发现，乙腈-磷酸盐作为流动相时，色谱峰的拖尾因子及峰宽均随之降低，同时被测物与内标物也更加易于分离。但柱压较高影响色谱柱使用寿命，系统平衡以及检测后色谱柱冲洗时间较长；乙腈-水系统和甲醇-水系统的分离效果相当，峰均无拖尾；甲醇-水系统的保留时间要短于乙腈-水系统。综合考虑流动相对仪器及色谱柱的损害情况以及实验成本，课题组选择甲醇-水系统作为最终的流动相。

治疗药物监测作为临床药学一个重要分支，是在药物代谢动力学理论的指导下，运用高通量、高精密度的化学分析技术，测定病人血液或其它体液中的药物浓度，获取相关药代动力学参数；大多数药物药理作用的强弱以及持续时间的长短均与药物在受体部位的浓度呈正比，血药浓度与药物的治疗效果或毒性反应均具有一定的相关性。因此，根据药物浓度进行临床合理用药方案的制订或调整，有助于提高药物治疗的安全性和有效性［11］。

此外，癫痫病人需要长期的院外自行服药，脱离了医护人员的监管，容易出现漏服药、少服药以及不服药等依从性较差的情况。所以对癫痫病人进行定期的门诊血药浓度监测，也有助于对病人的服药依从性进行判断，进而为临床准确地诊断病情提供参考依据［12］。

本研究建立了一种新的拉莫三嗪血药浓度的HPLC监测方法，该方法简便、快速、准确适合在临床推广应用。