长链非编码RNA UC001kfo表达水平与宫颈癌病人预后的相关性研究

田丹，李新，尚学琴，罗雁

宫颈癌（Cervical Cancer）是常见的妇科恶性肿瘤，高发年龄原位癌为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来宫颈癌的发病有年轻化的趋势。宫颈癌的典型表现为接触性阴道出血，阴道流液，常见病理类型为鳞癌、腺癌和腺鳞癌3种类型，其中以鳞癌（60%～80%）最为常见［1］，目前宫颈癌的标准治疗方案是以手术、放疗和化疗为主的综合治疗［2］。尽管随着宫颈癌疫苗的推广和各种治疗手段的进步，近几年的发病率和死亡率都有所下降，但是宫颈癌的诊断效率和疗效仍有待提高。此外，中国人口众多，仍有很多的女性病人饱受宫颈癌及治疗不良反应带来的痛苦，因此全面深入的研究以提高宫颈癌诊断技术及治疗疗效任重而道远［3］。

长链非编码RNA（long non coding RNA，LncRNA）是指转录长度大于200个核苷酸，不参与编码蛋白质的一类长链RNA。最初人们认为LncRNA是基因转录过程中的副产物，并不参与细胞的其他生物效应，但近年来研究显示LncRNA与肿瘤的发生、发展密切相关［4］。研究表明LncRNA在正常组织及肿瘤组织中表达水平存在明显差异，LncRNA可分别在转录和转录后水平调控宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌和绒毛癌等肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭［5］，因此，LncRNA与妇科恶性肿瘤的发生和发展关系密切。研究发现LncRNA UC001kfo在肝癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌以及膀胱癌等多种肿瘤中呈高表达，提示UC001kfo与肿瘤的发生发展密切相关，但其生理病理功能和作用机制尚未明确［6-10］。目前国内外关于UC001kfo在宫颈癌中的相关研究鲜有报道。本研究通过比较宫颈癌病人癌组织及癌旁组织UC001kfo的表达差异，分析UC001kfo与宫颈癌病人临床病理特点及预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料收集整理2012年4月2日至2017年2月2日云南省第二人民医院收治的81例行手术切除的宫颈癌病人的宫颈癌、癌旁组织标本及其病例资料。所有病人术前均经病理学检查确诊为宫颈癌，术前均未行化疗、放疗以及其他特殊治疗，术后病理再次确诊为宫颈癌，病人临床诊疗资料完整。所需组织切除离体后立即取材，获取组织标本控制在离体10～30 min，标本获取后置于冻存管并立即保存在液氮中。宫颈癌诊断及其常规病理资料由2位经验丰富的病理科医师阅片后确诊。术后分期方法采用国际妇产科协会（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）的分期标准。81例宫颈癌病人的年龄范围为30～61岁，中位年龄为41岁；年龄＜40岁病人为39例，年龄≥40岁为42例；Ⅰ期15例，Ⅱ期22例，Ⅲ期35例，Ⅳ期9例；鳞癌69例，腺癌12例；无淋巴结转移32例，淋巴结转移49例。69例病人接受了术后放和（或）化疗。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，所有病人或其近亲属签署知情同意书。

1.2随访全部病人术后出院后均进行随访，每3～6月随访1次，方式为电话、门诊或再入院诊疗时随访，内容包括一般情况、临床症状体征、全身体格检查和影像学（B超、CT和MRI等）检查。总生存时间为手术后到病人因肿瘤死亡的时间。肿瘤死亡定义为因肿瘤本身或肿瘤相关并发症导致的临床死亡。随访起始日为术后病理确诊日期，末次随访时间为2018年6月22日，截止随访终止病人生存40例，死亡41例，无失访病例。

1.3实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（qPCR）采用qPCR检测宫颈癌组织及癌旁组织中UC001kfo的表达。收集宫颈癌病人癌组织及其癌旁组织标本，将匀浆的组织参照Trizol试剂（美国Invitrogen公司）说明书提取总RNA进行检测。然后参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（中国赛默飞世尔科技公司）说明中的操作步骤及注意事项将总RNA逆转录为cDNA，进行qPCR。相关的引物序列如下：内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的正向引物序列为5′-AATCCCATCACCATCTTC-CAG-3′，反向引物序列为5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′；UC001kfo的正向引物序列为 5′-GCCAACGCAAGAAGTTACCA-3′；反向引物序列为5′-CCAAATCATTCCTAGCCAAAG-3′。比较宫颈癌组织与癌旁组织中UC001kfo基因表达的变化。所有样品做3个复孔。本实验以计算2-ΔΔCt值代表UC001kfo相对表达量，其中ΔΔCt=ΔCt样品-ΔCt对照=（Ct样品UC001kfoCt-Ct样品GAPDH）-（Ct对照UC001kfo-Ct对照GAPDH）。

1.4统计学方法使用SPSS 20.0软件进行数据的录入、整理和统计学分析。计量数据以±s表示。宫颈癌组织及其癌旁组织中UC001kfo表达的差异采用t检验进行比较；UC001kfo表达水平与宫颈癌病人临床病理特征的关系采用χ2检验进行分析。采用Kaplan-Meier法分析各组病人生存时间，并行Log-rank检验，Cox回归模型用于宫颈癌预后的多因素分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1UC001kfo在宫颈癌组织中表达及其与病人预后的关系qPCR检测结果显示81例宫颈癌病人癌组织UC001kfo的表达（4.694±1.378）明显高于癌旁组织（1.543±0.598），差异有统计学意义（t=18.751，P=0.000）。本研究根据UC001kfo在癌组织及其癌旁组织中表达水平将全部病人分为UC001kfo高表达组和低表达组，高表达组定义为宫颈癌组织UC001kfo表达量/癌旁组织表达量＞2；低表达组定义为宫颈癌组织UC001kfo表达量/癌旁组织表达量≤2［10］，其中高表达组病人为 50 例，低表达组为31例。

通过分析UC001kfo表达与宫颈癌病人年龄、肿瘤大小和病理类型等临床病理特征的关系结果表明：UC001kfo的表达与宫颈癌病人的FIGO分期、淋巴结转移和肿瘤局部浸润深度关系密切，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表1。

表1 UC001kfo表达水平与宫颈癌病人临床病理特征的相关性/例（%）

2.2UC001kfo表达对病人生存期的影响采用Kaplan-Meier法分析UC001kfo表达与病人生存期关系，81例宫颈癌病人的中位生存期23.0个月，总体1、3和5年生存率分别为77.3%、55.1%和48.7%。UC001kfo低表达组和高表达组宫颈癌病人的中位生存期分别是49.0个月和35.0个月。与UC001kfo低表达组比较，高表达组病人的中位生存期明显缩短，差异有统计学意义（χ2=5.663，P=0.019），详见图1。

图1 宫颈癌81例中UC001kfo表达水平与生存期的关系

Cox回归多因素分析发现UC001kfo表达水平、FIGO临床分期、淋巴结转移和肿瘤浸润深度为影响宫颈癌病人生存预后的独立危险因素，详见表2。

表2 Cox多因素分析宫颈癌81例临床病理特征与预后的关系

3 讨论

从分子生物学角度更全面深入的研究宫颈癌生存预后相关的各种生物标志物具有重要临床意义。有研究发现 lncRNA H19、CRNDE、HOTAIR、MALAT1和MEG3等LncRNA与宫颈癌的发生发展和临床预后相关［11-12］。例如，有研究报道在宫颈癌组织中MALAT1表达上调，临床分析显示MALAT1高表达与宫颈癌病人肿瘤大小、临床分期、血管侵犯和淋巴结转移关系密切，是影响宫颈癌病人生存预后的独立危险因素，该研究还发现HPV可能通过MALAT1促进肿瘤生长［13-14］。另有研究报道HOTAIR在宫颈癌病人癌组织中的高表达与侵袭性强、预后不良和放疗敏感性等因素有关［15-16］，lncRNA为包括宫颈癌在内的多种妇科恶性肿瘤的诊断和治疗提供了新的方向。

潘延凤等［8，17］利用芯片杂交技术从肝硬化、肝癌、癌旁及门静脉转移的肝癌组织中筛选出了lncRNA UC001kfo，其编码基因位于Chr10（q23.31），共2 043 bp，UC001kfo和细胞骨架蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在染色体上存在部分区域的重叠，ACTA2的启动子在其重叠区域内，UC001kfo与ACTA2存在2段互补序列，并预测ACTA2可能是UC001kfo的靶基因，其靶蛋白可能是α-SMA。该团队进一步的研究发现UC001kfo高表达与肝细胞癌的大血管侵犯和TNM分期有关，UC001kfo高表达的肝癌病人总生存率和无进展生存率明显降低，单因素和多因素分析均提示TNM分期和UC001kfo高表达是肝细胞癌病人预后不良因素；此外，细胞和动物实验表明UC001kfo能够促进肝癌细胞的增殖、转移和上皮间质转化，其作用机制与α-SMA蛋白上调有关，该研究认为UC001kfo可以作为治疗肝细胞癌的理想靶点［18-21］。

研究发现UC001kfo与肺腺癌的发生密切相关，UC001kfo在肺腺癌癌组织中高表达，UC001kfo的高表达与肿瘤分化程度及淋巴结转移有关，UC001kfo高表达病人预后较差，UC001kfo表达水平是影响肺腺癌病人无进展生存时间和总生存时间的独立因素（P＜0.05）［7，22］。研究人员通过建立UC001kfo过表达的非小细胞肺癌A549细胞模型，采用蛋白质抗体芯片技术筛选UC001kfo功能相关的靶蛋白，结果表明UC001kfo通过增加BMP-5和SCFR蛋白的表达从而促进肺癌的发生发展［10］。与以上研究结论不同，黄秋霞等［9］研究发现UC001kfo在乳腺癌组织中呈低表达，UC001kfo低表达与高临床分期呈负相关，UC001kfo可能在乳腺癌发生中起抑癌作用，作者分析其原因可能与不同肿瘤细胞微环境诱导的UC001kfo表达差异有关。目前lncRNA UC001kfo在宫颈癌中的作用尚未明确。本研究结果提示，与癌旁组织相比，UC001kfo在宫颈癌病人癌组织中呈高表达，为进一步探讨UC001kfo的表达水平与宫颈癌病人临床预后的关系，本研究分析了UC001kfo的表达与各种临床病理因素的关系，结果表明UC001kfo表达较高的病人临床分期晚，淋巴结转移率高，局部浸润明显，生存期较低表达者明显缩短，UC001kfo的表达水平是影响宫颈癌病人生存预后的独立危险因素。

综上所述，UC001kfo在宫颈癌组织中高表达，UC001kfo高表达与宫颈癌病人的预后不良有关，UC001kfo为宫颈癌的诊断、治疗及其预后提供了新的研究方向，UC001kfo在宫颈癌中作用及其机制尚无确切结论，有待进一步研究。