贮前强制对流热空气处理对低温胁迫下青椒果实AsA-GSH循环代谢的影响

邵婷婷，姜雪，张敏,2,3,4*，赵昱瑄，郝爽，厉建国

1(上海海洋大学 食品学院，上海，201306) 2 (上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海，201306) 3(上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，上海，201306) 4 (食品科学与工程国家级实验教学示范中心(上海海洋大学)，上海，201306)

青椒又名灯笼椒、柿子椒、甜椒等，是茄科的一种[1]。其果肉脆嫩，颜色鲜艳，富含大量的VC，是一种营养价值极高且深受消费者欢迎的蔬菜。青椒果实作为我国北运的主要蔬菜之一，常采用低温运输，且采摘后的青椒果实为了延长其贮藏期也常采用低温贮藏。当青椒果实的低温贮藏温度低于其冷害临界温度时会导致冷害现象的发生[2-5]，严重时还会影响青椒果实的商品价值和可食用价值，造成严重的经济损失。正常生长的果蔬细胞内存在一个完善的活性氧产生和清除的保护系统，对于未采摘的青椒果实来说，其细胞内的活性氧水平较低，且其产生和清除一直处在一个动态平衡中，活性氧不会积累，进而也就不会伤害其细胞组织。但是当采摘后的青椒果实冷藏时会受到逆境胁迫，其细胞对O2的利用能力降低，活性氧产生和清除系统的动态平衡会被打破，活性氧产生速率加快，而活性氧清除酶的活性和内源抗氧化物含量降低将会造成活性氧的大量积累，甚至会诱发膜脂过氧化的发生，造成细胞受到一定程度的伤害[6]。AsA-GSH循环[7]是植物体内清除活性氧的主要途径，参与该循环的抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)和还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)是具有多种氧化功能的物质，其含量的降低可作为植物抗氧化能力衰退的指标。因此，研究合适的果蔬贮前处理方式对AsA-GSH循环的影响具有重要意义。

在众多的处理方式中，热空气处理拥有条件简单、经济成本低、易操作、无化学残留等优点，同时相对热水处理而言，更易减少个体相互之间的接触碰撞，而且减少了热水处理过程中病原菌污染等情况，因而有着广阔的应用市场。朱赛赛等[8]研究得出45 ℃热空气处理西葫芦果实20 min能够减缓其膜脂过氧化进程，激发抗氧化酶活性。AMBVKO等[9]研究发现热空气处理能够提高香蕉果实低温贮藏期间活性氧清除能力，并且AsA-GSH循环中的关键酶抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)的活性也得到提高。在侯建设等[10]的试验中，贮前经50 ℃、10 min或53 ℃、5 min热水处理的青椒，较未处理组而言，显著提高了青椒APX活性，维持了活性氧代谢的平衡，抑制膜脂过氧化，具有更好的抗冷害性能。孙海燕等[11]的实验结果表明，用(55±1)℃热水处理30 s后的青椒，在(10±1)℃的低温贮藏，能在一定程度上减缓青椒中丙二醛(MDA)含量的增加速率，降低腐烂指数，较好地保持了AsA含量，延长了青椒的贮藏期，提高了其耐贮性。王静等[12]研究表明，48 ℃、30 min热空气处理对降低青椒病害率，延缓AsA含量的下降效果较好；60 ℃、30 min热空气处理可阻止叶绿素含量的下降，有效地抑制青椒果实呼吸强度上升，但其并未对青椒果实低温胁迫下AsA-GSH循环进行研究。同时也有报道显示热空气处理对草莓[13]、鲜枣[14]和杨梅[15]的低温保鲜过程中的活性氧代谢都有很好的调节作用。而有关强制对流热空气处理对于青椒果实采后低温胁迫下AsA-GSH循环清除活性氧的研究却鲜有报道。本试验在前期研究的基础上，发现强制对流热空气(风速：2 m/s)处理温度为50 ℃可以有效降低青椒果实的冷害率，因此本文重点研究在此条件强制对流热空气处理对低温胁迫下青椒果实AsA-GSH循环的影响，以期为青椒果实贮藏保鲜和揭示采后果蔬热应激在低温胁迫下的抗冷性响应机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青椒：选用“洛椒”青椒作为试验材料，于2018 年7月 4日采于上海市南汇新城镇果园，装于泡沫箱中当天运回实验室。

盐酸羟胺、NaOH、酚酞、石英砂、CaCO3粉、丙酮、草酸、抗坏血酸、2,6-二氯靛酚钠盐、Na2HPO4、冰醋酸、还原性谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、硫代巴比妥酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；H2O2试剂盒(科研试剂),南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

BPS-100CA型恒温恒湿培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；H-2050R-1型高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机有限公司；THZ-82A型恒温振荡箱，江苏省金坛市环宇科学仪器厂；BJ2100D型数字孔式电子天平，台湾精达电子仪器有限公司；DDS-307型电导率仪，上海笛柏实验设备有限公司；HSWX-600BS型电热恒温水温箱，上海圣科仪器设备有限公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。240 mm真空干燥器，上海帅登仪器有限公司。

1.3 材料处理

挑选无明显机械损伤、无病虫害、色泽均一的新鲜青椒果实，装于泡沫箱中当天运回实验室。果实平均长度为14～17 cm，平均质量为60～90 g。将青椒果实清洗干净后拭干分组。根据前期试验结果，选取有效强制对流热空气(风速：2 m/s；相对湿度：85%～90%)、处理温度为50 ℃，来研究该温度下处理青椒果实5、10、20、30和40 min，另外不经过处理的青椒果实设为对照组，进而研究不同的强制对流热空气处理时间对青椒果实低温胁迫下细胞内AsA-GSH循环代谢的影响。将各组青椒果实处理后放于干净的实验台上晾干后贴上标签，再装入厚度为0.03 mm的聚乙烯保鲜袋，最后放于(4±0.5)℃、相对湿度为(80±5)%的冷库中贮藏，整个贮藏周期为21 d，每隔3 d取出青椒样品观察各组的冷害指数并测定其贮藏品质、活性氧自由基含量以及AsA-GSH循环关键酶的酶活性，重复3次。

1.4 指标测定

1.4.1 冷害指数的测定

冷害指数的测定参照侯建设等[16]的方法来对青椒果实的冷害指数进行评定。通过观察青椒果实果面所呈现出的冷害面积将冷害症状分为4级。其中，0级：无冷害症状；1级：轻微冷害，冷害斑不超过果面的10%；2级：中度冷害，冷害斑占果面积的10%～40%；4级：严重冷害，冷害斑超过果面的40%。

(1)

1.4.2 叶绿素和可滴定酸含量的测定

叶绿素的测定采用分光光度计[17]测定。准确称取1 g青椒样品于预冷的研钵中，加入少量石英砂和CaCO3粉及2～3 mL 80%的丙酮溶液，研磨成匀浆，再用80%的丙酮溶液进行冲洗过滤，收集滤液待测。

可滴定酸(titritable acidity,TA)含量的测定采用酸碱滴定法[18]进行测定。

1.4.3 电解质外渗率和丙二醛含量的测定

电解质外渗率的测定参考卢佳华等[19]的测定方法略作修改。从青椒果实样品果面较宽处用打孔器取10个圆片放入有编号的烧杯中，准确加入20 mL去离子水后放于恒温振荡箱在转速为150 r/min，环境温度为25 ℃的条件下振荡10 min后，加入20 mL去离子水并用DDS-307电导率仪测定此时的电导率值，并记为R0。再将之放入真空干燥器、恒温振荡培养箱中各1 h，结束后测定此时的电导率并记为R。用保鲜膜覆于烧杯上并把烧杯于沸水中煮沸10 min，煮沸结束后静待恢复至室温，测定此时的电导率R′。记录试验结果，并用公式(2)来算出电解质外渗率。

(2)

丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)的方法分别测定450、532和600 nm的吸光值，并利用公式(3)计算青椒果实的MDA含量。

c/(μmol·L-1)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450

(3)

过氧化氢(H2O2)含量的测定采用H2O2测试盒测定[20]。

1.4.5 AsA和GSH含量的测定

AsA含量的测定参考王慧等[22]的试验方法，采用2,6-二氯靛酚法进行测定。

还原型谷胱甘肽(GSH)的测定参考曹建康等[21]的方法稍作修改。称取5.0 g青椒果实样品置于预冷好的干净研钵中，加入5.0 mL经4 ℃预冷的50 g/L的三氯乙酸溶液(含5 mmol/L EDTA-Na2),在冰浴条件下研磨成匀浆后，于4 ℃、12 000×g离心20 min。收集上清液待测。

1.4.6 GR和APX活性的测定

谷胱甘肽还原酶(GR)活性的测定参考王萍等[23]的方法稍作修改。称取5.0 g青椒果实样品置于预冷好的干净研钵中，加入5.0 mL经4 ℃预冷的0.1 mol/L、pH 7.5的H3PO4缓冲液(含1 mmol/L EDTA)，冰浴条件下研磨成匀浆后，于4 ℃、12 000×g离心30 min。收集上清液用于酶活性测定。

抗坏血酸过氧化物酶(APX)活力的测定活性测定参照CHEN等[24]的方法，以每克样品APX酶促反应体系在290 nm处吸光度值降低0.01为1个酶活性单位。

1.5 数据处理与分析

数据采用Excel 2010软件处理，SPSS 19.0 软件绘图进行差异性分析。本文所有试验为3次重复，试验结果为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 强制对流热空气处理对冷藏青椒果实冷害指数的影响

图1体现了各处理组青椒果实低温贮藏期间的冷害指数变化趋势，从图中可知50 ℃强制对流热空气处理20 min组青椒果实出现冷害的时间最晚，比对照组推迟了6 d。且在整个低温贮藏期，50 ℃强制对流热空气处理20 min组青椒果实的冷害指数在各处理组中一直处于较低水平，贮藏结束时也仅为31.25%，而50 ℃强制对流热空气处理5、10、30、40 min以及对照组的青椒果实冷害指数分别达到了53.13%、43.75%、54.16%、65.63%、和70.25%。

图1 强制对流热空气处理对青椒果实冷害指数的影响Fig.1 Effect of forced convection hot air treatment on chilling injury index of green pepper fruit注：不同小写字母表示各处理组之间差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 强制对流热空气处理对冷藏青椒果实叶绿素和可滴定酸含量的影响

强制对流热空气处理对青椒果实低温胁迫下叶绿素含量的影响见图2。

图2 强制对流热空气处理对青椒果实叶绿素含量的影响Fig.2 Effect of forced convection hot air treatment on chlorophyll content of green pepper fruit

由图2可以看出各处理组青椒果实的叶绿素含量呈现出不同幅度的下降趋势，但50 ℃强制对流热空气处理20 min组的青椒果实的叶绿素含量在整个低温胁迫下一直处于较高水平，始终高于其他各处理组。随着冷藏时间的延长，各组青椒果实由于冷害程度加深，果实表皮发生褐变，果实内叶绿素含量下降幅度加大，到贮藏结束时，50 ℃强制对流热空气处理20 min组青椒果实的叶绿素含量维持在0.069 mg/100 g，显著高于其他各处理组。结果表明，虽然各个处理组的青椒果实的叶绿素都呈下降趋势，但50 ℃强制对流热空气处理20 min能够使其降解速度减缓，进而提高青椒果实低温胁迫下的抗冷性。

由图3可以看出，各组青椒果实的可滴定酸含量呈现出不断下降的趋势。随着冷藏时间的延长，青椒果实冷害程度加深，各组的可滴定酸含量也随之下降，且到了贮藏后期下降幅度加剧，但是对于50 ℃强制对流热空气处理20 min来说，其青椒果实的可滴定酸下降幅度一直低于其他各处理组。贮藏到第9天时，其可滴定酸含量仍高达0.28%，显著高于其他各处理组。

图3 强制对流热空气处理对青椒果实可滴定酸含量的影响Fig.3 Effect of forced convection hot air treatment on titratable acid content of green pepper fruit

2.3 强制对流热空气处理对冷藏青椒果实电解质外渗率和MDA含量的影响

由图4可以看出，各组青椒果实在整个低温贮藏期间的电解质外渗率数值呈现出一直上升的趋势，说明各组青椒果实随着低温贮藏时间的延长都发生了不同程度的冷害现象。但是各组青椒果实由于其贮前热空气处理时间的不同，其电解质外渗率数值的上升幅度存在很大差别。贮藏到15 d时，50 ℃热空气处理20 min组青椒果实的电解质外渗率数值仅比刚开始贮藏时增加了15%，而50 ℃强制对流热空气处理5、10、30、40 min和CK组分别增加了28%、18%、21%、35%和38%。说明50 ℃强制对流热空气处理20 min对于长期低温贮藏的青椒果实来说，能够有效保护其细胞结构的完整性，一定程度上提高其抗冷性。

由图5可以看出，各组青椒果实的MDA含量在整个低温贮藏期间大致呈现出不断上升的趋势。在贮藏前3 d，各组青椒果实的MDA含量有一个轻微的下降，说明贮藏前期各组青椒果实的膜脂过氧化反应并没有快速进行。而后随着低温贮藏时间的延长，50 ℃强制对流热空气处理5、30、40 min以及对照组青椒果实的MDA含量呈现出急剧上升的趋势，50 ℃强制对流热空气处理10和20 min组青椒果实的MDA含量增加幅度较为缓慢，且50 ℃强制对流热空气处理20 min组青椒果实的MDA含量仅为0.00104 μmol/g，显著低于其他各组。由此说明50 ℃强制对流热空气处理20 min能够减缓青椒果实低温贮藏期间的膜脂过氧化反应，降低其产物MDA的积累，进而保护细胞免受伤害。

图4 强制对流热空气处理对青椒果实电解质外渗率的影响Fig.4 Effect of forced convection hot air treatment on electrolyte extravasation rate of green pepper fruit

图5 强制对流热空气处理对青椒果实MDA含量的影响Fig.5 Effect of forced convection hot air treatment on MDA content of green pepper fruit

2.4 强制对流热空气处理对冷藏青椒果实H2O2和含量的影响

由图6可知，各种青椒果实中H2O2的含量呈现出一直上升的趋势。在贮藏前期，各组青椒果实中H2O2的含量并无显著性差别。贮藏到第6天以后，在同一贮藏时间下各组青椒果实中H2O2的含量由高到低的变化顺序为40 min组>CK组>30 min组>5 min组>10 min组>20 min组。从图中观察可知，50 ℃强制对流热空气处理40 min组青椒果实的H2O2含量在后期高于CK组，说明该处理方式对减缓细胞H2O2的产生并无明显作用。

图6 强制对流热空气处理对青椒果实H2O2含量的影响Fig.6 Effect of forced convection hot air treatment on H2O2 content of green pepper fruit

图7 强制对流热空气处理对青椒果实产生速率的影响Fig.7 Effect of forced convection hot air treatment on rate of green pepper fruit

2.5 强制对流热空气处理对冷藏青椒果实AsA和GSH含量的影响

由图8可知各处理组青椒果实的AsA含量都呈现出下降趋势。在贮藏前期，由于青椒果实发生冷害程度较轻，所以各组青椒果实的AsA含量下降幅度较低。贮藏到15 d时，50 ℃强制对流热空气处理20 min组青椒果实的AsA含量维持在81.67 mg/100 g，而50 ℃强制对流热空气处理5、10、30、 40 min以及CK组青椒果实的AsA含量分别为66.33、69.00、65.01、62.00和58.67 mg/100 g，显著低于50 ℃强制对流热空气处理20 min。且一直到贮藏结束，其他各组青椒果实的AsA含量始终低于50 ℃强制对流热空气处理20 min，说明50 ℃强制对流热空气处理20 min较为合适，能有效抑制青椒果实低温贮藏期间AsA的下降。

由图9可知，各组青椒果实中GSH含量大致呈现出先增加后下降的趋势，且在第9天达到峰值。各处理青椒果实GSH的峰值按从高到低的顺序变化为20 min组>10 min组>30 min组>5 min组>40 min 组>CK组。而后随着低温贮藏时间的延长，各组青椒果实的GSH含量都逐渐下降，到贮藏结束时ck以及5、10、30和40 min组青椒果实的GSH含量分别为0.22、0.32、0.48、0.41以及0.21 μmol/g， 而20 min组青椒果实的GSH含量仍维持在0.71 μmol/g。该结果表明，50 ℃强制对流热空气处理20 min能够大幅度增加青椒果实低温贮藏期间GSH的含量，且对于其含量的保持也有很明显的效果，有助于青椒果实的抗逆性提升。

图8 强制对流热空气处理对青椒果实AsA含量的影响Fig.8 Effect of forced convection hot air treatment on ascorbic acid content of green pepper fruit

图9 强制对流热空气处理对青椒果实GSH含量的影响Fig.9 Effect of forced convection hot air treatment on GSH content of green pepper fruit

2.6 强制对流热空气处理对冷藏青椒果实GR和APX活性的影响

由图10可知，各组青椒果实的GR活性呈现出先上升后下降的趋势，于第12天达到峰值。50 ℃强制对流热空气处理20 min组青椒果实的GR活性峰值最大，为CK组的2.75倍。到了贮藏后期，各组青椒果实的GR活性急剧下降，到贮藏结束时，各组青椒果实的GR活性分别为8.93、11.88、15.58、9.03、7.39和5.67 U/mg。说明50 ℃强制对流热空气处理20 min对于维持青椒果实的GR活性效果较好，始终处于各个处理组的最大值，进而使该组青椒果实清除活性氧的能力增强，提高其抗冷性，有利于果实品质的保持。

采后青椒果实随着低温贮藏期间的延长其APX的活性变化如图11所示，各组均呈现出先增加后下降的变化趋势。

图10 强制对流热空气处理对青椒果实GR活性的影响Fig.10 Effect of forced convection hot air treatment on GR activity of green pepper fruit

图11 强制对流热空气处理对青椒果实APX活性的影响Fig.11 Effect of forced convection hot air treatment on APX activity of green pepper fruit

3 讨论

前人研究表明热空气处理能够提高西葫芦、香蕉、草莓、鲜枣和杨梅[11-15]等果蔬在冷藏时的抗逆性，能够有效推迟其冷害发生时间。低温贮藏的果蔬经过一段时间的复温之后会出现不同程度的冷害症状。青椒果实的冷害症状一般表现为：果皮变暗，表皮产生不规则的凹陷斑，凹陷部位果肉中的维管束褐变等[25]。冷藏的青椒果实随着贮藏时间的延长，其体内的叶绿素以及可滴定酸等含量会出现一定程度的下降，叶绿素含量的下降可能会导致果实表皮暗淡无光，光泽降低，可滴定酸含量下降则会影响青椒果实的口感和风味。因此，常用叶绿素和可滴定酸含量的保持作为衡量果实贮藏效果的标志，也可作为鉴别果实贮藏品质中的化学指标。本试验结果表明，50 ℃强制对流热空气处理20 min能够显著减轻青椒果实的冷害症状，在整个低温胁迫下其冷害指数均保持在较低水平。50 ℃强制对流热空气处理40 min 组的青椒低温保鲜效果较差，冷害症状严重，可能是长时间的强制对流热空气处理使得青椒果实表面失水严重，抗逆性降低。青椒果实的叶绿素和可滴定酸含量在低温贮藏期间的下降趋势得到了减缓，表明50 ℃强制对流热空气处理20 min能够提高青椒果实低温胁迫下的抗逆性，进而使其叶绿素含量和可滴定酸含量得到较好维持。

4 结论