工业蛋白水解酶快速检测方法的建立与初步应用

宋鹏,程磊，田康明，王正祥*

1(天津科技大学 生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津,300457)2(天津科技大学 化工与材料学院，天津,300457)

蛋白水解酶是水解蛋白质肽链的酶的总称，是一类重要的工业酶制剂，在食品、发酵、医药、纺织和洗涤等工业中具有重要应用价值[1-7]。依据蛋白质水解后新生成的氨基和羧基的数量、肽键减少数或特定游离氨基酸生成量，蛋白水解酶活力的检测方法主要有双缩脲法(Biuret法)、福林法(Folin法)、茚三酮法、三硝基苯磺酸法(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sol,TNBS法)和邻苯二甲醛法(o-phthalaldehyde,OPA法)等[8]。我国现行有关蛋白酶酶活测定的国家和行业标准中，主要采用福林法[9-11]。此法的检测原理是，依据蛋白质底物经水解后游离酪氨酸和色氨酸释放量，定量蛋白酶的活力水平[12]。

蛋白水解酶是现今研究中最为复杂的水解酶系，成员众多，水解方式迥异。通过上述原理建立起来的酶活检测方法，存在明显的局限性。例如，内肽酶是制备功能性寡肽的重要酶类，偏好水解远离多肽链末端的内部肽键，通过上述酶活测定方法显然无法满足对其酶活的快速和灵敏检测[12-16]。因为部分内肽酶水解蛋白质后，所释放的新生氨基和羧基的数量、肽键减少数或特定游离氨基酸量都处于相对较低的水平，甚至不会释放福林法检测所依赖的酪氨酸和色氨酸。

1997年，JONES等采用氟硼荧荧光素标记酪蛋白，基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术原理，建立了胃蛋白酶等活力的均相检测方法，此法在无需对检测产物进行分离的情况下，首次实现了对蛋白酶活力的快速灵敏检测，可检测到极微量(ng级)蛋白酶的活力[17]。此法及其衍生方法先后成功用于多种蛋白水解酶或其抑制剂的检测、动力学分析及高通量筛选与分析研究[18-21]。

为了高效开发应用于食品加工、皮革制造、制药、环保和发酵工业等领域的新型蛋白酶制剂，本文以氟硼荧荧光素标记大豆分离蛋白，以此为底物建立起蛋白水解酶活力的快速均相检测方法，并就其方法学特征与可能的应用价值进行分析。所建立的新方法可以应用于现有工业蛋白酶制品的快速定量检测，并有助于蛋白水解酶新酶的研究与开发。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白，上海源叶生物科技有限公司；胰蛋白酶1∶250(>250 U/mg)，北京索莱宝生物科技有限公司；木瓜蛋白酶(≥100 000 U/g)、米曲霉酸性蛋白酶(≥100 000 U/g)、枯草杆菌中性蛋白水解酶(≥200 000 U/g)和地衣芽胞杆菌碱性蛋白水解酶(≥200 000 U/g)，江苏锐阳生物科技有限公司；其他蛋白水解酶为本实验室前期制备与保存。

BODIPY NHS Ester，西安瑞禧生物科技有限公司；PD-10脱盐柱，上海根生生物科技有限公司；冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；Tecan infinite 200多功能酶标仪，瑞士Tecan公司；L-酪氨酸和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；福林酚，索莱宝生物科技有限公司；所用的其他化学品均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 荧光素分子标记大豆分离蛋白

参考HAUGLAND[22]的方法以BODIPY NHS Ester标记大豆分离蛋白制备荧光底物。基本步骤为：适量荧光素溶液(5 mg BODIPY NHS Ester溶于0.5 mL DMSO)与10倍体积蛋白溶液(10 mg大豆分离蛋白溶于1 mL 0.1 mol/L NaHCO3缓冲液，pH 8.5)混合，置于200 r/min摇床，室温下避光反应2 h；反应混合物通过PD-10脱盐柱去除游离荧光素分子，收集蛋白组分，冷冻干燥，于-20 ℃避光保存备用。

1.2.2 均相法检测蛋白水解酶活力

以缓冲液溶解荧光底物至10 μg/mL，与适度稀释的酶液分别预热至40 ℃，各取100 μL加入96孔板混匀，40 ℃下反应10 min，用酶标仪在激发波长500 nm、发射波长530 nm条件下检测荧光。以底物和酶液作为对照。蛋白水解酶的活力用相对荧光强度(RFU)表示，按公式(1)计算：

RFU=FC-(FA+FB)

(1)

式中：FC为样品荧光值；FA为底物荧光值；FB为酶液荧光值。

1.2.3 均相法的线性检测范围

以福林法[9]检测胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、米曲霉酸性蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白水解酶和地衣芽胞杆菌碱性蛋白水解酶，5种工业蛋白酶活力。适度稀释酶液，按1.2.2项方法于相应最适pH下反应并检测荧光。以各蛋白酶福林法活力为横坐标(X)，均相法相对荧光强度为纵坐标(Y)绘制标准曲线。

1.2.4 均相法的检测限(DL)和定量限(QL)

按照1.2.3项建立的回归直线方程确定DL和QL[23]，由方程(2)和(3)计算所得：

DL=3×Sb1/b

(2)

QL=10×Sb1/b

(3)

式中：Sb1为10个空白溶液的标准偏差；b为回归方程的斜率。

1.2.5 均相法的检测稳定性

配制一定浓度的胰蛋白酶溶液，按1.2.2项方法于pH 7.0(0.02 mol/L磷酸盐缓冲液)下反应并检测荧光，每个浓度检测6个平行样品，计算6次检测结果的相对标准偏差(RSD)。

1.2.6 均相法筛选新型蛋白水解酶

以本实验室制备的8种内肽酶SubA、MepB、NadA、Sed2、PepX、HypB、DppD和ProtB为检测对象，用福林法检测酶活，适度稀释后用均相法检测酶活。

2 结果与分析

2.1 均相法的线性范围

福林法标定的5种蛋白酶分别稀释后用均相法进行酶活测定，结果汇总于图1。

图1 均相法相对荧光值和福林法酶活力之间的线性关系Fig.1 Linearity between relative fluorescence value of homogeneous method and enzyme activity determined by Folin method

胰蛋白酶检测线性范围为0.025～0.4 U/mL，拟合回归方程为：y= 461 988x-744.45(R2=0.999 6)；米曲霉酸性蛋白酶检测线性范围为0.02～0.5 U/mL，拟合回归方程为：y=473 787x+4 831.6(R2=0.999)；枯草杆菌中性蛋白酶检测线性范围为0.02～0.4 U/mL，拟合回归方程为：y=470 829x-786.29(R2=0.993 5)；地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶检测线性范围为0.025～0.4 U/mL，拟合回归方程为：y=572 251x+6 592.9(R2=0.996 8)；木瓜蛋白酶检测线性范围为0.02～0.5 U/mL，拟合回归方程为：y=494 355x+319.87(R2=0.999 6)。在特定酶活范围内，所测相对荧光强度与相应蛋白酶活力均呈现良好的线性关系，但各回归方程斜率及线性范围有所不同，这是基于2种检测方法的原理不同。均相法检测中，高浓度荧光分子以酰胺键结合在底物蛋白分子的N-末端氨基或侧链(赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺)氨基，各荧光分子在空间距离上足够接近而处于FRET状态，只显示极低荧光值，底物水解后肽键断裂，底物蛋白构象发生改变，各荧光分子空间距离随之变化，打破原来的FRET状态，在激发光照射时显示较高的荧光强度[24]。均相法检测中荧光强度变化可以真实反映蛋白底物的肽键水解情况。福林法[12]检测中，部分水解产物被三氯乙酸沉淀，而可溶部分又仅以酪氨酸和色氨酸进行显色，不能全面反映蛋白底物的肽键水解情况。蛋白酶具有水解肽键的偏好性，作用于同一底物，不同蛋白酶对应产物的大小及氨基酸组成均有不同[1]。因此，对于5种所测试的工业蛋白酶，相同的福林法酶活力对应的均相法相对荧光强度有所不同，表现为回归方程斜率和线性范围差异。

2.2 均相法的检测限(DL)和定量限(QL)

检测10个空白溶液平行样本并计算标准偏差，根据5种工业蛋白酶均相法检测的回归方程，确定相应检测限和定量限，结果汇总于表1。

表1 均相法的检测限和定量限Table 1 Detection limit and quantitative limit of homogeneous method

均相法检测5种工业蛋白酶的检测限和定量限结果接近但存在一定差异。如前所述，此差异仍由均相法和福林法检测原理不同所致。均相法检测5种工业蛋白酶的检测限范围为1.1×10-4～1.4×10-4U/mL，定量限范围为3.7×10-4～4.5×10-4U/mL，相比国标福林法推荐的检测范围10～15 U/mL，均相法检测灵敏度提高20 000倍以上。

2.3 均相法的稳定性

选择胰蛋白酶考察均相法的稳定性，在线性范围最低浓度(0.025 U/mL)、中间浓度(0.25 U/mL)及最高浓度(0.4 U/mL)做平行检测，结果汇总于表2。各检测点6次平行检测确定的相对标准偏差都小于3%，表明均相法稳定性较好。

表2 均相法的稳定性分析结果Table 2 Stability analysis of homogeneous method

2.4 均相法用于蛋白水解酶的筛选

用均相法和福林法同时检测8种内肽酶的酶活，结果汇总于表3。8种内肽酶的酶活用均相法全部检出，而福林法仅检测出其中3种内肽酶(SubA、MepB和PepX)的酶活。在均相法检测结果中，NadA和Sed2酶活均高于PepX，后者以福林法可检测出酶活，前2者却未能检出。根据检测原理可知，NadA和Sed2对底物的水解作用强于PepX，但酶解产物中酪氨酸、色氨酸或相关寡肽的浓度却低于PepX。HypB、DppD和ProtB以均相法检测显示出活力，说明其对底物有水解作用，但因酶解产物中酪氨酸、色氨酸或相关寡肽的浓度过低而不能由福林法检测出酶活。

表3 均相法和福林法检测多种内肽酶酶活比较Table 3 Detection of endopeptidases by homogeneous method and Folin method

注：括号内数值为酶活检测pH值。

3 讨论

本文以BODIPY NHS Ester荧光素分子标记大豆分离蛋白作为荧光底物，成功建立起工业蛋白酶活力的快速微量检测方法。其线性检测范围、检测限、定量限和稳定性等，可以满足对常见工业蛋白酶活力的定量分析，与福林法所获得的活力检测结果也具有良好的对应关系。

福林法、茚三酮法、OPA法等传统的蛋白水解酶活力测定方法，都需要对产物和底物进行分离后检测，并需要显色过程，操作步骤多，检测耗时长[12,14,16]。本文建立的均相检测法无需分离产物和底物，酶和底物反应完成后可以立刻读取荧光值计算酶活，显著提高了检测效率，且灵敏度远高于福林法。

均相法检测是依据底物(蛋白质)在蛋白水解酶作用后，其空间结构被破坏，FRET状态解除，经直接读取反应体系的荧光强度变化，进行酶活检测与定量[24]。据此原理，除以小分子量寡肽为底物的蛋白水解酶外，其他蛋白水解酶都可用均相法进行活力检测与定量分析。运用所建立的方法，对采用福林法检测活力比较困难的内肽酶，实现了活力测定，印证了均相法的检测范围更广、灵敏度更高，结果显示本法在研究新型蛋白水解酶时具有重要价值。

综上所述，本文建立了一种高效快速、可以替代福林法进行工业蛋白水解酶活力检测的方法。该方法的最大价值体现在对新型蛋白水解酶的检测中，可以拓展新酶的发现。