积雪草苷调控GRP78/PERK/CHOP通路对急性心肌梗死大鼠的心肌保护作用研究∗

杨 勇 殷红珍 胡云飞

（1.安徽省滁州市第一人民医院，安徽 滁州 239000；2.皖南医学院弋矶山医院，安徽 芜湖241000；3.皖南医学院，安徽 芜湖 241000）

急性心肌梗死（AMI）是冠状动脉急性狭窄或者闭塞，引起供血骤然减少或者终止，心肌严重缺血或坏死的急性病证，AMI具有发病急、致残率、死亡率高等特征［1］。凋亡是引起心肌细胞死亡的主要形式。近年来研究证实，内质网应激是除了线粒体和死亡受体通路外的另一细胞凋亡通路［2］。细胞在缺氧缺血等多种因素下会引起细胞内未折叠或者错误折叠的蛋白集聚，激活内质网特异性分子伴侣葡萄糖调节蛋白78（GRP78），进而启动内质网应激（ERS）反应，促使未折叠或者错误折叠的蛋白恢复正确构象，对细胞发挥保护作用，但应激时间过长，则会启动ERS凋亡信号通路GRP78/蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）/转录因子C、EBP同源蛋白（CHOP），诱导细胞凋亡［3］。积雪草苷（AC）是中草药积雪草的提取物。药理研究表明，AC具有抗氧化、保护缺氧心肌细胞、保护血管内皮细胞的作用［4］。AC可显著改善心肌梗死大鼠的胶原异常表达和心肌纤维化作用［5］。目前关于AC对急性心肌梗死大鼠内质网通路的研究较少，本研究通过制备急性心肌梗死大鼠模型，探究AC基于GRP78/PERK/CHOP通路对大鼠的心肌保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF8周龄级SD大鼠108只，体质量230～260 g，由郑州大学实验动物中心提供，合格证号为SYXK（豫）2018-0002；实验动物均按照动物饲养规则由专人饲喂，室内温度25℃，湿度60%，通风良好。

1.2 试药与仪器 1）试药：积雪草苷片（AC）（上海医药研究工业研究院，国药准字Z200541446），牛磺酸（Tau）（美国Sigma公司），Bax、Caspase-12、Caspase-3、Bcl-2单抗（美国CST公司），GRP78单抗（美国Sigma aldrich公司）、PERK、CHOP单抗（英国Abcam生物公司），羊抗鼠IgG二抗（Santa Cruz公司），2，3，5-苯氯化四氮唑（TTC）（美国Amresco公司），苏木素、伊红染液（美国Sigma公司），Trizol、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒（invitrogen公司），BCA试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）。2）仪器：1659001蛋白电泳仪（美国Bio-Rad公司）；GIS-500凝胶成像仪（Miulab公司），CFX96 PCR仪（美国BioRad公司），DW-2000小动物呼吸机（上海嘉鹏科技有限公司），3K15低温离心机（美国Sigma公司），SpectraMax M5酶标仪（美国molecular devices公司）。

1.3 模型制备 大鼠适应性饲喂1周后，参考文献［6］制备心梗模型，禁食12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉，仰卧位固定，呼吸机辅助；左胸部纵切口开胸，小心分离心包膜，轻压右侧胸壁，暴露心脏，左心耳下1 mm处以7-0线结扎左冠状动脉前降支近侧端，结扎后肢体导联心电图J点抬高（≥0.2 mV），提示心肌梗死造模成功；假手术组仅在相应部位穿线不结扎左冠状动脉。排除胸腔内气体和残留积血，逐层关胸、恢复自主呼吸拔除气管插管，术后注射抗生素预防感染。

1.4 分组及给药 实验大鼠按照随机数字表法分为假手术组，模型组，积雪草苷低、中、高剂量组，牛磺酸组，每组均18只。造模完成24 h后，假手术组、模型组大鼠灌胃等量0.9%氯化钠注射液，各组用饮用水溶解药物，积雪草苷低、中、高剂量组分别灌胃给药1.62、3.24、6.48 mg/（kg·d），牛磺酸组灌胃牛磺酸药液300 mg/（kg·d），每天早晚各1次，治疗4周［5］。

1.5 标本采集与检测 1）TTC染色观察大鼠心肌梗死面积。治疗4周后，每组随机选取6只大鼠称质量，麻醉并开胸取心脏，冰生理盐水冲洗并用滤纸吸干多余水分，左心室称质量，计算左心室质量/体质量的比值。心肌组织切为5片，置于2%TTC磷酸盐缓冲液中，避光浸染30 min，每5分钟翻动1次；4%多聚甲醛中固定20 h，吸干组织表面清水，采用IPP图像分析系统进行分析，计算大鼠心肌梗死面积百分比。红色为正常心肌，白色为心肌梗死区。2）HE染色观察大鼠心肌组织病理学变化。治疗4周后，麻醉大鼠取心脏，4%多聚甲醛固定制备石蜡切片；常规二甲苯脱水；苏木精染色10 min，流水冲洗；盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗；伊红复染30 s，梯度乙醇脱水2 min，石炭酸二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察切片。3）TUNEL法检测心肌细胞凋亡。制备心肌组织石蜡切片，参照TUNEL试剂盒说明书进行检测；心肌组织切片经Proteinase处理15～30 min，PBS漂洗；实验组加TUNEL反应混合液（50 μL TaT酶+450 μL荧光素标记的dUTP液混匀）50 μL，阳性对照不加TaT酶，室温反应60 min，PBS清洗3次，加入DAB、20%甘油缓冲液封片；滴加1滴PBS荧光显微镜计数，每张切片计算5个不同视野，计算TUNEL阳性细胞数。4）Western blotting检测心肌组织蛋白表达。适量心肌组织，RIPA裂解液裂解组织，匀浆组织样品，冰上裂解，提取总蛋白；BCA法测定蛋白浓度；变性蛋白50 μg进行SDSPAGE，浓缩胶（5%）电压80 V，分离胶（10%）电压120 V，电泳后转膜至PVDF膜上；5%脱脂奶室温封闭1 h，一抗（GRP78、PERK、CHOP、Bax、Bcl-2、Caspase-12）1∶500稀释，4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次；二抗1∶5000稀释，室温1 h，TBST清洗3次；ECL显影，凝胶成像系统观察，拍照，以β-actin为内参进行灰度值比较。

1.6 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差分析有统计学意义的，再次采用SNK-q或LSD-t进行两两比较；计数资料用n表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠基本情况 假手术组大鼠无死亡情况，造模过程中因麻醉、24 h急性心力衰竭、气胸等原因死亡的大鼠20只，术后24 h存活率为81.48%。模型组术后第8天死亡1只，积雪草苷低剂量组第12天死亡1只。术后4周，假手术组大鼠18只，积雪草苷中、高剂量组、牛磺酸组大鼠各14只，模型组、积雪草苷低剂量组大鼠13只。

2.2 各组大鼠左室质量、体质量、左室梗死面积比较见表1，图1。各组大鼠，体质量比较无显著差异；与假手术组比较，模型组左室质量和左室质量/体质量的比值显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，不同剂量积雪草苷和牛磺酸治疗后，左室质量、左室质量/体质量和左室梗死面积的比值显著下降（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组梗死面积显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，不同剂量积雪草苷组和牛磺酸组治疗后，梗死面积均明显下降（P＜0.05），提示积雪草苷和牛磺酸可发挥减少心肌梗死面积，保护心肌的作用。

表1 各组大鼠左室质量、体质量、左室梗死面积比较（±s）

与假手术组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与积雪草苷低剂量组比较，#P＜0.05；与积雪草苷中剂量组比较，▲P＜0.05。下同

组别假手术组模型组积雪草苷低剂量组积雪草苷中剂量组积雪草苷高剂量组牛磺酸组n 6 6 6 6 6 6左室质量（mg）512.31±42.34724.92±60.17*654.14±54.23*△574.37±50.65*△#525.46±46.29△521.37±44.54△#▲体质量（g）226.04±15.12223.07±14.51227.10±12.19231.20±13.45230.07±14.21228.02±12.54左室质量/体质量（mg/g）2.27±0.543.25±0.65*2.46±0.57*△2.35±0.48△2.31±0.43#2.29±0.49左室梗死面积（%）—45.68±6.8437.16±6.12△23.55±5.26△#13.67±5.07△#▲10.81±5.18△#▲

图1 TTC染色观察心肌梗死

2.3 各组大鼠心肌细胞凋亡计数比较 见表2，图2。TUNEL染色检测凋亡细胞，阳性核仁计数结果显示与假手术组比较，模型组凋亡细胞比例显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，积雪草苷各组和牛磺酸组细胞凋亡比例显著减少（P＜0.05），提示积雪草苷和牛磺酸可减少心肌细胞凋亡比例。

表2 各组大鼠心肌细胞凋亡计数比较（%，±s）

表2 各组大鼠心肌细胞凋亡计数比较（%，±s）

组别假手术组模型组积雪草苷低剂量组积雪草苷中剂量组积雪草苷高剂量组牛磺酸组n666666心肌细胞凋亡2.17±0.0440.12±5.23*31.46±5.67*△#▲25.37±3.16*△#18.06±2.79*△#▲15.73±2.10*△#▲

图2 各组大鼠心肌细胞凋亡情况（TUNEL染色，200倍）

2.4 各组心肌细胞形态比较 见图3。HE染色显示假手术组心肌纤维排列整齐，横纹清晰，分布均匀，无水肿或坏死；模型组心肌纤维不规则，横纹不清或缺失，大面积心肌坏死，间质水肿伴中性粒细胞浸润；积雪草苷低、中、高剂量组和牛磺酸组心肌纤维轻度扩张，心肌纤维局灶性丢失，未见心肌坏死。

图3 各组大鼠心肌细胞形态（HE染色，200倍）

2.5 各组内质网应激分子GRP78、PERK、CHOP蛋白表达比较 见图4，表3。Western blotting检测显示，与假手术组比较，模型组GRP78、PERK、CHOP蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，积雪草苷各组和牛磺酸组GRP78、PERK、CHOP蛋白表达显著降低（P＜0.05），而积雪草高剂量组与牛磺酸组PERK、CHOP蛋白表达水平无显著差异。积雪草各组呈剂量依赖性降低。

图4 各组内质网应激分子GRP78、PERK、CHOP蛋白表达

表3 各组内质网应激分子GRP78、PERK、CHOP蛋白表达（±s）

表3 各组内质网应激分子GRP78、PERK、CHOP蛋白表达（±s）

与假手术组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与积雪草苷低剂量组比较，#P＜0.05；与积雪草苷中剂量组比较，▲P＜0.05；与积雪草苷高剂量组比较，☆P＜0.05。下同

组别假手术组模型组积雪草苷低剂量组积雪草苷中剂量组积雪草苷高剂量组牛磺酸组n 6 6 6 6 6 6 GRP780.17±0.020.84±0.05*0.71±0.06*△0.52±0.04*△#0.34±0.05*△#▲0.19±0.02△#▲☆PERK 0.16±0.010.87±0.08*0.66±0.07*△0.41±0.03*△#0.18±0.02△#▲0.17±0.01△#▲CHOP 0.17±0.010.63±0.06*0.40±0.04*△0.31±0.02*△#0.17±0.02△#▲0.16±0.01△#▲

2.6 各组凋亡蛋白Bax和Bcl-2、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达比较 见图5，表4。Western blotting检测显示，与假手术组比较，模型组Bax、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达水平显著升高，Bcl-2蛋白水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，积雪草苷各组随剂量的升高Bax、Caspase-12、Caspase-3蛋白显著降低，Bcl-2蛋白升高（P＜0.05），均呈剂量依赖性，且积雪草苷高剂量组与牛磺酸组蛋白无显著差异。

图5 各组凋亡蛋白Bax和Bcl-2、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达

表4 各组凋亡蛋白Bax和Bcl-2、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达（±s）

表4 各组凋亡蛋白Bax和Bcl-2、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达（±s）

组别n Bax Caspase-12Caspase-3Bcl-2假手术组模型组积雪草苷低剂量组积雪草苷中剂量组积雪草苷高剂量组牛磺酸组6 6 6 6 6 60.18±0.020.75±0.04*0.61±0.10*△0.48±0.05*△#0.20±0.06△#▲0.18±0.03△#▲0.17±0.010.77±0.07*0.69±0.03*△0.40±0.03*△#0.18±0.12△#▲0.17±0.01△#▲0.47±0.060.80±0.05*0.69±0.06*△0.38±0.04*△#0.19±0.02*△#▲0.19±0.03*△#▲0.48±0.050.16±0.02*0.20±0.03*△0.26±0.04*△#0.39±0.03*△#▲0.43±0.03△#▲

3 讨论

积雪草属于伞形科植物，主要含有三萜皂苷类物质，是多版《中国药典》的收藏品种。研究证实，积雪草对热证、痈疽、皮肤创伤、瘢痕的治疗效果良好［7］。AC是积雪草三萜皂苷类的重要成分，研究显示，AC具有抗炎作用，可保护大鼠原代心肌细胞的缺氧复氧损伤［8］。AC对人成纤维细胞具有明显的增殖促进作用。AC在心梗大鼠中具有明显的抗炎、抗纤维化作用，可抑制非梗死区转化生长因子-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达，减轻心肌梗死后心肌纤维化［5］。研究显示，AC处理后，急性心肌梗死大鼠左心室功能得到显著改善［9］。目前关于AC对AMI大鼠保护作用的通路研究则较少，本研究通过构建急性心肌梗死大鼠模型，探究AC对AMI大鼠心肌保护作用。根据结扎后大鼠肢体导联心电图J点抬高，提示造模成功。本研究中，与假手术组比较，模型组左室质量和左室质量/体质量的比值显著增加，心肌梗死面积著增加，心肌细胞凋亡率显著增加；AC干预后，大鼠左室质量和左室质量/体质量的比值，梗死面积、细胞凋亡比例显著减少，HE染色显示，模型组心肌纤维不规则，横纹不清或缺失，积雪草苷各组和牛磺酸组心肌纤维轻度扩张，心肌纤维局灶性丢失。提示AC对模型大鼠心肌组织具有保护作用，是治疗心肌梗死的潜在药物。

近年来内质网应激通路引起了国内外学者的重视，ERS与AMI后心室重建引起的细胞凋亡关系密切。内质网是调控蛋白折叠与Ca2+稳态重要的细胞器，当机体出现缺氧、缺糖、缺血、大量自由基堆积、Ca2+稳态破坏等应激情况时均可引起内质网障碍，导致细胞凋亡［10］。UPR是内质网标记分子，应激条件下，ERS和GRP发挥保护细胞的作用，应激过度，应激时间过长，则会启动内质网应激凋亡信号通路GRP78/PERK/CHOP，PEPK诱导CHOP表达增加，激活Caspase-12促进细胞凋亡［11］。心肌肥大心力衰竭大鼠模型中，GRP78、CHOP表达显著增加［12］。小猪左冠状动脉前降支放置收缩环，导致小猪心力衰竭，诱导ERS相关的CHOP、Caspase-12凋亡通路，促进心肌细胞凋亡［13］。研究报道，低糖可促进大鼠内质网应激通路的激活，促进GRP78、PERK、CHOP通路蛋白表达增加［14］。本研究显示，AMI组GRP78、PERK、CHOP、Caspase-12蛋白表达水平显著升高，AC处理后，积雪草苷各组GRP78、PERK、CHOP、Caspase-12蛋白表达降低，提示心肌梗死促进GRP78-PERK-CHOP的激活，AC抑制GRP78-PERK-CHOP的激活，这表明AC可通过抑制ERS通路抑制细胞凋亡。

研究显示，CHOP凋亡通路与线粒体凋亡通路密切相关，CHOP可下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，引起促凋亡蛋白Bax易位到线粒体，发挥促凋亡作用［15］。研究报道，CHOP通过激活Caspase-12进而激活下游Caspase-3、Caspase-9的表达，促进Capase级联反应的发生，促进细胞凋亡，促进神经损伤［16］。本研究显示，AMI大鼠Bax蛋白表达水平显著升高，Bcl-2蛋白水平显著降低，AC处理后，积雪草苷各组和Tau组Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白升高，提示AC可抑制细胞的凋亡以发挥其对心肌细胞的保护作用。

综上所述，AC可以减少心肌梗死面积，降低凋亡细胞数量，改善心肌组织病理变化，其可能是通过抑制GRP78/PERK/CHOP通路的激活，抑制凋亡相关通路，发挥对心肌细胞的保护作用。