电针联合疼痛贴对骨癌痛大鼠的抗抑郁作用机制

覃双来，关江锋，吴永贵，张秋

0 引言

疼痛是中晚期癌症患者的主要并发症，有研究报道，癌痛的发生率高达70%以上[1]，严重影响患者的生存质量，甚至成为患者求医的主要原因。由于疼痛产生的不良刺激和体验，癌痛患者普遍存在抑郁状态，其抑郁情绪发生率高达86.7%[2]，临床多表现为情绪低落、兴趣缺乏、疲乏、睡眠障碍等。已有研究证实了疼痛与抑郁之间存在相关性[3-4]，抑郁的发生及程度与疼痛的有无、分级呈正相关，疼痛是癌症患者产生抑郁的主要因素[5]。癌痛和抑郁是互相影响的，癌痛可引起抑郁，抑郁又会加重患者对疼痛的感知和体验，从而使患者陷入癌痛-抑郁的恶性循环，生存质量严重降低，甚至导致肿瘤的复发、转移、恶化等[6-7]。因此，识别及治疗并发抑郁的癌痛患者，逐渐成为临床医生需要解决的迫切任务。

通过电针联合疼痛贴对骨癌痛大鼠的镇痛作用实验，发现胫骨癌痛模型大鼠伴随有神情呆滞、活动度降低、饮食减少、毛发干枯等抑郁样行为，考虑该模型存在抑郁样改变，而针刺和疼痛贴具有较好的急慢性镇痛作用，可能会缓解疼痛对胫骨癌痛模型大鼠产生抗的抑郁作用。本研究采用旷场实验、悬尾实验和强迫游泳实验观察胫骨癌痛模型大鼠行为学的改变，并从氧化应激的角度探索其机制，为临床上推广应用提供理论依据和实验数据。

1 材料与方法

1.1 动物来源

雄性SPF级SD大鼠（180～200 g）及幼鼠（60～80 g），实验动物及饲料均购于湖北省实验动物研究中心，许可证号SCXK（鄂）2015-0018。于湖北中医药大学中医药实验中心（实验动物中心）饲养，许可证号SYXK（鄂）2012-0067。室温18℃～20℃，相对湿度50%～60%，12 h昼夜循环灯照，动物自由进食、饮水，适应性饲养3天后进行造模。所有实验动物的处置均符合科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 试剂与材料

G A P D H抗体（s c-3 2 2 3 3）、B c l-2（sc-23960）、Caspase-3抗体（sc-373730）购自美国Santa Cruz公司，NE（N-069）、DA（H8502）和5-HT（25003）购自美国Sigma公司。Walker-256乳腺癌细胞购自武汉大学生物中心。丙二醛测定试剂盒、过氧化氢酶测定试剂盒（S0131）、HRP二抗、PVDF膜、甲醇、ECL、10%水合氯醛购自中国武汉谷歌生物公司。旷场实验分析系统（JLBehv-LA，上海吉量），Triple Quad 6420TMLC/MS/MS系统（Agilent Technologies, 美国），韩氏穴位神经刺激仪（LH202H，中国，HANS），电泳仪（Powerpac HC，美国Bio-Rad），多色荧光凝胶成像系统（Universal HoodⅢ，美国Bio-Rad）。疼痛贴由川乌、草乌、延胡索、马钱子、徐长卿、乳香、没药、土鳖虫、蟾酥、冰片及薄荷脑等中药材碾粉，按照一定比例混合基质（100 g药粉加入甘油30 g，乳化剂8 g，单甘脂20 g，羊毛脂20 g，凡士林40 g）后制成药膏，由武汉市第一医院制剂中心提供。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分组 Walker-256乳腺癌细胞注射至幼鼠腹腔（4×107cells/ml），接种7天后收集癌性腹水，离心3 min（1 300 r/min），沉淀后，用10 ml PBS洗涤，再次离心沉淀，然后以PBS重悬计数，调整至适当浓度（4×106cells/ml），置于冰盒内备用。对大鼠进行适应性刺激，筛选出连续3天的机械缩足阈值（mechanical withdrawal threshold, MWT）≥26 g的大鼠，参照Medhurst的方法[8]建立胫骨癌痛模型。腹腔注射10%水合氯醛（4 ml/kg）麻醉大鼠，仰卧位固定于操作台上，右侧膝关节部位备皮，碘伏消毒皮肤。在无菌条件下，左手固定膝关节使其表面皮肤紧张，用7号针头在膝关节髌韧带内侧缘沿胫骨纵轴往胫骨远端钻孔，深约1 cm。然后用微量进样器往胫骨骨髓腔内注入4 μl肿瘤细胞，最后推入2 μl凝胶海绵溶液封口。另有大鼠12只，注射等量PBS后推入2 μl凝胶海绵溶液封口，作为空白组。所有试剂注射后均留针1 min，防止注射物渗出。术后9～13天MWT持续≤8 g的大鼠视为造模成功，成模率约为50%。建立大鼠胫骨癌痛模型，挑选表现有神情呆滞、活动度降低、饮食减少、毛发干枯等抑郁样行为的大鼠48只，随机分为四组：模型组、电针治疗组（电针组）、疼痛贴治疗组（疼痛贴组）、电针联合疼痛贴治疗组（联合治疗组），各组分笼饲养，做进一步实验。

1.3.2 干预方法 空白组与模型组正常饲养，无特殊干预。电针组：按照《实验针灸学》定位，将大鼠躯干固定于布制的柔软鼠套中，露出头部，待大鼠安静后用碘伏消毒，“百会”穴向后头部平刺进针，“印堂”穴向鼻尖平刺进针，用0.25 mm×13 mm针灸针直刺5～10 mm接电针，通过韩氏穴位神经刺激仪给予“疏密波”，电针频率为2 Hz/100 Hz，刺激强度为0.5～1.5 mA，以穴位局部出现皮肤肌肉轻微颤动为宜，持续30 min。疼痛贴组：在大鼠背部对称两侧脱毛处皮肤上敷贴疼痛贴，6 h后去除药物。联合组：电针治疗并贴敷疼痛贴。各组自造模成功后第3天起，每天干预1次，连续12天，干预完成后30 min内完成指标测定。

1.3.3 取材方法 造模后12天完成相关测定后处死大鼠，取出大脑眶额叶，液氮冻存一周后转入-80℃冰箱冻存。

1.3.4 旷场实验 实验箱为80 cm×80 cm×80 cm的方形玻璃盒子。清洁实验箱后，将其放在与计算机上旷场实验分析软件相连的隔音箱中。将大鼠放在实验箱中央观察15 min，记录大鼠自由活动，应用动物行为视频跟踪分析系统跟踪记录5 min，分析大鼠的活动总路程。

1.3.5 悬尾实验（TST） 将大鼠尾部固定后使大鼠头部距离底面约5 cm，适应2 min后以摄像机进行记录大鼠的不动时间。计算2～6 min大鼠的无肢体挣扎的不动时间总和。

1.3.6 强迫游泳实验（FST） 强迫游泳实验在直径23 cm高60 cm装满一半水的测试桶中进行。实验前大鼠禁食不禁水12 h。在造模前1天进行预实验，大鼠强迫游泳15 min后回笼, 在造模第12天进行正式实验：记录5 min内大鼠在水中停止挣扎、呈漂浮状态，或仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面的不动时间。

1.3.7 HPLC检测眶额叶单胺类神经递质 取冻存的眶额叶组织50 mg，加入0.2 mmol/L高氯酸沉淀蛋白，12 000 r/min离心5 min后取上清液，饱和K2CO3调pH后上机分析。色谱柱：IntersilODS-3C18柱（5 μm, 150 mm×4.6 mm）。流动相：柠檬酸钠缓冲盐（pH4.5）-乙腈（87:13, v/v）。流速：0.8 ml/min。

1.3.8 TBA法检测丙二醛（MDA）的含量 根据MDA检测试剂盒说明书操作。取冻存的眶额叶20 mg按照1 mg/10 μl加入0.9%氯化钠溶液进行匀浆，5 000 r/min离心15 min后取上清液进行测定。

1.3.9 可见光法检测过氧化氢酶（CAT）活性 取20 μl预处理的眶额叶匀浆上清液，加入100 μl底物（65 mmol/L过氧化氢的磷酸缓冲盐溶液，pH7.4）37℃反应1 min后立即加入钼酸铵终止反应，405 nm处测定吸光度值。CAT活性以U/mg protein表示。

1.3.10 Western blot检测Bcl-2和Caspase-3在各组中的表达变化 取-80℃冻存的各处理组大鼠眶额叶标本50 mg，加入组织裂解液后在冰上使用电动匀浆器匀浆。离心获得组织蛋白提取液后以BCA法定量。SDS-PAGE电泳，湿转，封闭，加入特异性抗Bcl-2（1:1 500）、Caspase-3（1:500）、GAPDH一抗（1:2 000），4℃孵育过夜后加入HRP标记的二抗（1:5 000）孵育1 h，用PBST洗涤3次后加入ELC试剂，在多色荧光凝胶成像系统下显色成像。结果用Quantity One图像分析系统进行条带光密度分析，目的蛋白与内参条带灰度的比值作为蛋白表达的相对含量。

1.4 统计学方法

实验数据采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。多组之间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），所有样本采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑郁行为学实验结果比较

在旷场实验中，模型组、电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠的活动里程低于空白组（P=0.000、0.000、0.000、0.001）；电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠的活动里程高于模型组（均P=0.000）。在悬尾实验中，模型组、电针组、疼痛贴组大鼠的不动时间多于空白组（P=0.000、0.000、0.003）；电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠的不动时间少于模型组（P=0.008、0.000、0.000）。在强迫游泳试验中，模型组、电针组、疼痛贴组大鼠的不动时间高于空白组（P=0.000、0.000、0.005）；电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠的不动时间低于模型组（P=0.005、0.000、0.000），见表1。

表1 抑郁行为学实验结果比较Table1 Comparison of depression behavioral testresults

2.2 单胺递质测定结果比较

模型组、电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠眶额叶脑组织的NE含量低于空白组（均P=0.000）；电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠眶额叶脑组织的NE含量高于模型组（P=0.023、0.000、0.000）。模型组、电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠眶额叶脑组织的DA含量低于空白组（P=0.000、0.000、0.000、0.025）；电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠眶额叶脑组织的DA含量高于模型组（均P=0.000）。模型组、电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠眶额叶脑组织的5-HT含量低于空白组（均P=0.000）；疼痛贴组、联合治疗组大鼠眶额叶脑组织的5-HT含量高于模型组（均P=0.000），见图1。

图1 单胺递质测定结果比较Figure1 Comparison of monoamine transmitter test results

2.3 氧化应激测定结果

模型组、电针组、疼痛贴组大鼠眶额叶脑组织的MDA含量高于空白组（均P=0.000）；电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠眶额叶脑组织的MDA含量低于模型组（均P=0.000）。模型组、电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠眶额叶脑组织的CAT活性低于空白组（P=0.000、0.000、0.000、0.001）；疼痛贴组、联合治疗组大鼠眶额叶脑组织的CAT活性高于模型组（均P=0.000），见图2。

图2 氧化应激测定结果比较Figure2 Comparison of oxidative stress test results

2.4 Bcl-2、Caspase-3蛋白表达变化

模型组、电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠眶额叶脑组织的Bcl-2蛋白表达低于空白组（P=0.000、0.000、0.000、0.004）；疼痛贴组、联合治疗组大鼠眶额叶脑组织的Bcl-2蛋白表达高于模型组（均P=0.000）。模型组、电针组、疼痛贴组大鼠眶额叶脑组织的Caspase-3蛋白表达高于空白组（均P=0.000）；电针组、疼痛贴组、联合治疗组大鼠眶额叶脑组织的Caspase-3蛋白表达低于模型组（均P=0.000），见图3。

3 讨论

单胺递质缺乏假说是当前公认程度较高的抑郁症发病假说。抑郁症患者特别是自杀患者脑脊液中5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）浓度均低于正常值，5-HT转运体的结合位点显著减少，血小板和脑组织中5-HT的再摄取存在障碍。尸检发现抑郁症患者脑组织β-肾上腺素受体密度和亲和力增加，研究者推测这是肾上腺素能神经元突触减少后的继发表现[9]。有研究报道抑郁症患者的中脑-边缘多巴胺能神经系统中的多巴胺（DA）降低，而多巴胺对于调节动机和奖赏效应有重要作用，多巴胺的减少可能是兴趣和愉快感散失等抑郁症表现的机制之一。

图3 大鼠眶额叶脑组织中Bcl-2、Caspase-3蛋白表达变化结果比较Figure3 Comparison of change of Bcl-2 and Caspase-3 protein expression in orbital frontal lobe brain tissue of rats

在慢性痛和抑郁的发病过程中有氧化应激的参与，体内氧化与抗氧化作用失衡且倾向于氧化作用，体内因此产生了大量氧化中间产物进而引发组织损害。在氧化应激发生后，机体内的免疫系统被激活，并产生大量的炎性因子，致使中性粒细胞炎性浸润；下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）被激活，造成人体内分泌系统紊乱。有研究证实氧化应激与抑郁症发生有关联性：氧化应激指数增高则汉密尔顿抑郁评定量表得分也会相应地增高，反之则降低[10]。氧化应激的中间代谢产物如MDA的含量与疼痛的强度呈正相关。

旷场实验中模型组大鼠的活动里程低于空白组，而悬尾实验、强迫游泳实验中模型组大鼠的不动时间均高于空白组，提示与空白组相比，胫骨癌痛模型大鼠存在抑郁样行为学改变。模型组大鼠眶额叶脑组织的5-HT、NE、DA含量均明显低于空白组，提示疼痛导致脑内单胺类神经递质平衡失调。过氧化氢酶（CAT）属于酶抗氧化系统，模型组大鼠眶额叶脑组织的MDA含量高于空白组、CAT活性低于空白组，提示模型组氧化应激反应加重。氧化应激可以破坏细胞膜和蛋白质分子、降解细胞骨架、激活NF-κB和caspase-3通路，导致细胞的凋亡[11]。模型组Bcl-2表达减少，而Caspase-3蛋白增多，提示氧化应激引发抗凋亡因子减少和caspase-3通路激活，进而导致神经细胞凋亡，加重神经退行性改变，这可能也是胫骨癌痛模型大鼠抑郁样行为学改变的重要原因。

电针是现代科学与祖国医学的结合产物，用于抑郁症的治疗已经被证实疗效明确[12-13]。百会穴是百脉聚会于巅顶所在，是调节大脑功能的重要穴位，而印堂穴具有宁心安神的作用。针刺百会、印堂穴可以调补气血、健脑宁神、安神定志，对抑郁症的缓解有良好作用。

从中医理论来说，疼痛有虚实之不同，因实者谓“不通则痛”，因虚者谓“不荣则痛”。实性疼痛主要是由六淫外邪或者痰湿淤血等内邪阻滞经络，使经络不畅通，《黄帝内经》中有“经脉流行不止，环周不休，泣而不行，脉中则气不通，故卒然而痛”阐述，认为气血不通是疼痛产生的重要原因，此外，尚有由“风、寒、湿三气杂至合而为痹”而致的“不通则痛”。再者，虚性疼痛的另一主要病理机制为“不荣则痛”，多为气血消耗所致。但癌性疼痛现在临床上以“不通则痛”的病理性疼痛为主，故治疗的关键在于行气活血、散积止痛。

疼痛贴由蟾酥、生川乌、蚤休、莪术、细辛、乳香、没药等配制而成，由武汉市第一医院制剂室将中药碾粉末，以一定的比例加入基质混合，制成药膏，用时根据需要剂量的大小涂在医用布胶膏上，然后敷贴在相应的部位。中药外敷是临床治疗癌性疼痛常用剂型，依据“内病外治”理论配制而成。方中莪术、细辛、蟾酥、蚤休行气破血，配以乳香、没药活血散结止痛，并加用生川乌等药以止痛制痛。全方组方配伍得当，共奏行气活血、散积止痛之功。配以外敷贴剂，具有疗效确切、操作简便、价廉质优的特点。本研究进一步将电针与疼痛贴结合起来，可以发挥两种治疗方式的各自优势，而研究结果也证实了这一点。

旷场实验中三组治疗组大鼠的活动里程均高于模型组，而悬尾实验、强迫游泳实验中模型组大鼠的不动时间均低于模型组，提示电针治疗、疼痛贴治疗以及联合治疗均可以改善胫骨癌痛模型大鼠的抑郁样行为学改变。三组治疗组大鼠眶额叶脑组织的5-HT、NE、DA含量均明显高于模型组，提示电针治疗、疼痛贴治疗以及联合治疗可以纠正疼痛导致的脑内单胺类神经递质平衡失调。三组治疗组大鼠眶额叶脑组织的MDA含量低于模型组、CAT活性高于模型组，提示治疗后模型大鼠的抗氧化能力增强，氧化应激反应减轻，同时治疗组Bcl-2表达增多，而Caspase-3蛋白降低，提示电针治疗、疼痛贴治疗以及联合治疗可以减轻神经细胞凋亡，改善神经退行性改变，从而改善胫骨癌痛模型大鼠的抑郁样行为学改变。

综上，本研究结果肯定了电针治疗、疼痛贴治疗以及联合治疗的抗抑郁作用，并从单胺类神经递质平衡、抗氧化应激和减轻神经细胞凋亡的角度初步揭示了其机制，且多项指标反应出电针联合疼痛贴治疗较单纯的电针治疗和疼痛贴治疗更加有效，为扩大临床应用提供了思路和借鉴。未来应进一步深化研究并优化取穴，扩大治疗效果和应用范围。