FOXC1、CXCR4和MMP-7在肺腺癌组织中的表达及临床意义

2019-10-08葛红艳张正卫

国际检验医学杂志 2019年18期

葛红艳，张正卫

(南京医科大学附属淮安第一医院:1.检验科;2.病理科，江苏淮安 223001)

肺癌是严重危害人类健康的呼吸系统恶性肿瘤，随着工业的不断发展和环境污染问题的日益恶化，肺癌的发病率在世界范围内呈不断上升趋势；肺腺癌发病率较其他类型肺癌发病率低，肿块生长缓慢，更容易漏诊，大多数患者被诊断时已经为进展期肺腺癌，往往失去了根治性手术的机会[1-2]。近年来，除了不断完善肺癌患者的治疗外，寻求有效指导临床诊断的肿瘤标志物也成了肺腺癌研究的热点。本文分析了FOXC1，CXCR4及MMP-7在肺腺癌组织中的表达及意义，以期为肺腺癌病情严重程度的评估及预后判断提供参考资料。

1 资料与方法

1.1一般资料包含94对肺腺癌组织及对应癌旁组织的芯片购自上海芯超科技有限公司，有完整的临床、病理资料，标本来源的患者男51例、女43例，年龄30～84岁，平均(62.2±9.9)岁，无淋巴结转移者41例，有淋巴结转移者53例。根据第8版TNM分期标准，Ⅰ期31例、Ⅱ期24例、Ⅲ期38例、Ⅳ期1例，手术时间2004年7月至2009年6月，随访5～10年，患者术前均未经过化学治疗和放射治疗。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂仪器：CX31奥林巴斯摄影显微镜(日本Olympus公司)。试剂：兔抗人FOXC1抗体(稀释倍数1∶100)、CXCR4抗体(稀释倍数1∶100)、MMP-7(稀释倍数1∶100)和鼠抗兔二抗均购于Sigma公司，免疫组织化学试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2检测方法芯片经65 ℃烤片20 min后，使用二甲苯脱蜡，并用梯度乙醇脱水，经过5%的过氧化氢浸润，放置于37 ℃湿盒中孵育20 min；经磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后放置于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH值为6.0)中煮沸，自然冷却1 h用于抗原修复，使用羊血清工作液封闭非特异性抗原，滴加一抗置于4 ℃ 冷库中孵育过夜(每次实验均用已知阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照)，滴加生物素标记二抗，37 ℃孵育30 min；再滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉素卵白素，37 ℃孵育1 h，滴加二氨基联苯胺(DAB)显色。结果判读：采用评分法，将染色强度和阳性细胞百分数结合进行评分。染色强度基本不着色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，黄褐色计为3分。组织芯片置于显微镜下计数200个细胞，阳性细胞百分数<10%计为0分；10%～40%计为1分；40%～70%计为2分；>70%计为3分。两者相加0～2分评为阴性；3～6分为阳性[3]。所有免疫组化染色结果均采用双盲法进行病理读片。

1.3观察指标 (1)比较肿瘤组织和癌旁组织FOXC1、CXCR4和MMP-7蛋白阳性率；(2)分析肺癌患者FOXC1、CXCR4和MMP-7蛋白阳性率与其病理参数(性别、年龄、EGFR状态、肿瘤直径、TNM分期)、转移(淋巴结转移)的关系及三个指标间的相关性；(3)分析肺癌患者FOXC1蛋白阳性率与患者预后的关系。

1.4统计学处理采用SPSS18.0统计软件处理数据，组织蛋白表达与患者临床病理参数分析采用Pearson卡方检验进行分析，蛋白之间相关性采用Spearman等级相关分析，使用Kaplan-Meier法评估患者累积生存期，组间生存期的比较采用Log-Rank法。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1肿瘤组织和癌旁组织FOXC1蛋白、CXCR4蛋白和MMP-7蛋白阳性率情况比较 FOXC1、CXCR4和MMP-7在肺腺癌组织中的阳性表达率(分别为67.4%、55.8%和53.2%)明显高于相应癌旁组织(分别为11.6%、14.0%和10.5%)，差异有统计学意义(P<0.001)，见表1、图1。

2.2肺腺癌组织中FOXC1、CXCR4、MMP-7表达与临床病理特征关系分析 EGFR阳性、肿瘤直径T3～T4、淋巴结转移阳性和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者的FOXC1阳性率更高(P<0.05)；EGFR阳性、淋巴结转移阳性和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者的CXCR4和MMP-7阳性率更高(P<0.05)；FOXC1的阳性率与患者的性别、年龄无关，CXCR4的阳性率与患者的性别、年龄和肿瘤直径无关，MMP-7的阳性率与患者的年龄、肿瘤直径无关(P>0.05)。见表2。

表2 不同临床病理参数的患者FOXC1、CXCR4、MMP-7阳性率的比较[n(%)]

注：A为FOXC1蛋白在肺腺癌组织中的表达(SP ×200)；D为FOXC1蛋白在癌旁组织中的表达(SP ×200)；B为CXCR4蛋白在肺腺癌组织中的表达(SP ×200)；E为CXCR4蛋白在癌旁组织中的表达(SP ×200)；C为MMP-7蛋白在肺腺癌组织中的表达(SP ×200)；F为MMP-7蛋白在癌旁组织中的表达(SP ×200)

2.3FOXC1表达情况与肺腺癌患者预后情况分析对94例肺腺癌患者进行预后随访，肺腺癌组中的FOXC1蛋白表达阳性患者的累积生存率为5.2%(3/52)，低于FOXC1表达阴性患者的58.3 %(21/36)，差异有统计学意义(χ2=28.57，P<0.001)，见图2。单因素分析见表3。此外，多因素Cox回归分析显示，肺腺癌组织中FOXC1的表达是肺腺癌预后不良的独立危险因素[相对风险比(RR)=4.351，95%CI：2.417～7.834，P<0.001]。

图2 FOXC1蛋白不同表达患者的生存函数图

表3 肺腺癌患者预后因素的单因素分析

注：RR表示相对风险比

2.4肺腺癌组织中FOXC1蛋白、CXCR4蛋白和MMP-7蛋白表达之间的相关性分析采用Spearman等级分析方法对FOXC1蛋白、CXCR4蛋白和MMP-7蛋白表达之间的相关性进行分析，结果显示，FOXC1与CXCR4和MMP-7均呈正相关，差异有统计学意义(r=0.455、0.577，P<0.001)。

3 讨论

人类叉头盒(FOX)基因家族共有一个进化上保守的“叉头”或“翼-螺旋”DNA结合域，由40多个进化上保守的转录调节因子组成。FOX蛋白在多种生理病理过程如细胞增殖、分化和凋亡中起到重要作用[2]，并且FOX蛋白的失调控与发育障碍或肿瘤密切相关[4]。FOXC1是FOX转录因子家族的成员，之前已有研究报道FOXC1在乳腺癌、肝癌、胃癌的发生、发展中起到重要作用[5-7]，比如FOXC1可以通过调节MMP7促进基底样乳腺癌(BLBC)的侵袭性并且可以作为BLBC预后不良的标志物。本研究结果也显示，肺腺癌组织中FOXC1的表达明显高于癌旁组织，表明FOXC1可能参与肺腺癌的发生，其异常高表达可能导致肺腺癌组织上皮细胞过度增殖或突变，从而形成肿瘤。肺腺癌中FOXC1的表达与肿瘤的直径相关，肿瘤组织中FOXC1表达越高，肿瘤直径越大，结合以往报道FOXC1在子宫内膜癌和宫颈癌中促进肿瘤细胞增殖[8-9]，推测FOXC1也同样与肺腺癌增殖相关；FOXC1的表达越高，肿瘤越趋于淋巴结转移，同时FOXC1与转移相关蛋白CXCR4和MMP-7呈正相关，结合以往报道FOXC1在多种肿瘤如食管癌、胰腺癌和胃癌中促进肿瘤转移[2,7,10]，FOXC1可能也具有促进肺腺癌细胞转移的功能；FOXC1的表达越高，TNM分期越高，以上结果提示FOXC1促进了肺腺癌的发展。

虽然近年来肺腺癌患者总体生存时间不断提高，但是在接受标准化治疗后，部分肺腺癌患者仍然会发生局部复发和远处转移，直接影响了患者的寿命，这突出了肺腺癌患者预后评估的重要性。生存分析结果表明，FOXC1高表达的肺腺癌患者总体生存率较FOXC1低表达患者明显缩短。肺腺癌组织中FOXC1的表达是患者总体生存率的独立危险因素，提示FOXC1在肺腺癌中同样可以作为预后标志物，其高表达提示肺腺癌患者预后不良。

CXCR4属于跨膜G蛋白偶联受体，同时也是基质衍生因子-1的天然受体(SDF-1)[11-12]，在包括非小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌和结肠癌在内的多种肿瘤中高表达[13-16]，CXCR4促进上皮间质转化(EMT)过程，在肿瘤转移中起到重要作用[17-19]，基质金属蛋白酶(MMPs)属于锌依赖性同源蛋白酶家族，能够降解大多数细胞外基质(ECMs)。作为MMPs重要成员，MMP-7同样具有基质蛋白酶功能，在肿瘤迁移中起到关键的作用[20-21]。本研究发现，CXCR4和MMP-7在肺腺癌组织中高表达，并且FOXC1的表达与CXCR4和MMP-7均呈正相关，结合以往报道，推测FOXC1可能通过调控CXCR4和MMP-7促进肺腺癌的发生发展，但是肺腺癌中三者是否存在调控关系需要进一步实验验证。