湖北地区无创产前基因检测结果分析*

黄景涛，张 艳，吕志华，童永清，李 艳

(武汉大学人民医院检验科，湖北武汉 430060)

染色体非整倍体异常是导致新生儿缺陷的主要原因之一，常见的染色体异常有21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征和性染色体异常等等。1997年，有学者发现孕妇外周血中存在有胎儿的游离DNA[1]，结合近些年来高速发展的高通量测序技术，逐步开辟了无创产前检测技术(NIPT)。大量研究表明，NIPT对胎儿染色体非整倍体异常具有良好的检测效果[2]，可以准确、安全、快速地检测胎儿染色体非整倍体异常，在世界范围内都得到了广泛的应用。本研究选择了2016年1月至2017年12月在湖北省人民医院行NIPT的孕妇9 584例，对其基本资料(户籍、年龄、孕产史、胎儿DNA浓度、孕周等)及检测结果进行回顾性分析，探讨NIPT技术在临床中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2016年1月至2017年12月在湖北省人民医院就诊，自愿接受NIPT检测并签署知情同意书的早、中期孕妇9 587例纳入研究。筛查孕周范围为12至33+6周，年龄16～51岁。排除标准：双胎以上妊娠，夫妻双方或之一具有明确的染色体异常，1年内接受过异体输血、免疫治疗、干细胞移植、移植手术的孕妇。

1.2方法

1.2.1NIPT检测 获得孕妇知情同意后，取孕妇外周血5 mL，置于EDTA抗凝管中，4 ℃保存，8 h内分离血浆。采用磁珠法核酸提取试剂盒提取孕妇血浆中的游离DNA，以胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(博奥基因公司)、Ion OneTouchTM2和Ion OneTouchTMES仪(One Touch公司)进行文库构建，BioelectronSeq 4000基因测序仪(博奥基因公司)进行上机测序，每个样本的reads数必须大于3 M，胎儿DNA浓度必须大于4%。

1.2.2介入性产前诊断 NIPT检测结果为低风险孕妇，建议孕期随时进行超声检查排除胎儿畸形，若发现异常，建议进一步产前诊断；对于NIPT检测结果为高风险的孕妇，建议行染色体核型分析或采用染色体微阵列分析(CMA)进行产前诊断。其中染色体核型分析采用羊水或脐带血样本，按照细胞培养、制片、阅片过程进行核型分析；CMA采用CytoScan 750K(Affymetrix公司)芯片进行检测，操作参照说明书，结果分析采用Chas软件。

1.2.3随访 对于在本院产检及生育的孕妇，收集临床资料进行随访；在外院产检及生育的孕妇，采用电话随访。

2 结果

2.1湖北地区NIPT结果 2016年1月至2017年12月，本院共检测了湖北地区孕妇9 584例，平均年龄为(30.5±5.2)岁，平均孕周(18±2.8)周。9 584例孕妇中，NIPT提示高风险120例，阳性率为1.25%；其中21-三体高风险32例，18-三体高风险11例，13-三体高风险10例，性染色体异常36例，其余染色体异常31例。分析9 584例孕妇信息发现，来源武汉地区的孕妇为主，占52.6%(5037/9 584)，然后依次为黄冈[7.8%(752/9 584)]、襄阳[7.6%(724/9 584)]、孝感[6.8%(656/9 584)]、宜昌[6.2%(594/9 584)]、咸宁[5.8%(553/9 584)]、荆州[5.5%(528/9 584)]、恩施[2.5%(235/9 584)]和其他[5.3%(505/9 584)]，见表1。χ2检验发现，湖北各地区21-三体、18-三体、13-三体、性染色体异常和其余染色体异常高风险率差异无统计学意义(P>0.05)，湖北地区NIPT检测21-三体、18-三体、13-三体、性染色体异常和其余染色体异常高风险率分别是0.33%、0.11%、 0.10%、0.38%和0.32%。

表2 孕妇指征对NIPT结果影响[n(%)]

注：合计指具有任意染色体非整倍体异常；*表示P<0.05;#表示P<0.001

2.2孕妇指征对NIPT结果影响 将收集的孕妇样本按照年龄(<35岁和≥35岁)、有无不良孕产史、孕周(<18周和≥18周)和胎儿DNA浓度(4%～10%和大于10%)进行分组[3]，探究不同孕妇指征对于NIPT结果的影响，见表2。高龄(≥35岁)和有不良孕产史会导致NIPT高风险概率显著提高(P<0.05)，在<35岁的孕妇中，21、18、13-三体高风险、性染色体异常以及其余染色体异常的概率分别是0.20%、0.07%、0.07%、0.32%和0.25%，远低于高龄孕妇的高风险概率，见图1。另外，具有不良孕产史的孕妇，其21、18、13-三体高风险、性染色体异常以及其余染色体异常率分别是0.54%、0.25%、 0.18%、0.61%和0.64%，远高于无不良孕产史的孕妇，见图1。而孕妇孕周以及胎儿DNA浓度对于NIPT检测结果无影响。

2.3介入性产前诊断结果 本研究中共有120例孕妇NIPT检测结果为高风险，遗传咨询后，43例孕妇明确拒绝接受介入性产前诊断，其余77例孕妇接受染色体核型分析或染色体微阵列分析，见表3。介入性产前诊断发现21-三体、18-三体、13-三体、性染色体异常和其余染色体异常的阳性预测值分别是95.8%、85.7%、62.5%、53.8%和33.3%。随访至今未发现假阴性病例。

表3 介入性产前诊断结果

3 讨论

我国是出生缺陷的高发国家之一，资料显示每年新增的出生缺陷数大约为90万例，出生缺陷发现率约为5%[4]。最常见的出生缺陷原因是胎儿的染色体非整倍体异常，主要是21、18、13-三体和性染色体的非整倍体异常，占出生后染色体异常缺陷的85%。对于21、18、13-三体以及性染色体异常的早期筛查是十分必要的，传统的血清学筛查和超声筛查对于胎儿染色体异常风险的检出率为50%～90%，其中假阳性率约为5%，扩大了介入性产前诊断的范围，加重了孕妇的心理负担[5]。近年来伴随着二代测序技术的发展，NIPT-广泛应用于孕妇产前筛查过程中，可以有效地减少大量不必要的有创性产前诊断[6]。

在之前的研究中，NIPT对染色体高风险检出率不等，罗丽双等[7]对于5 756例孕妇外周血进行NIPT筛查，结果提示21-三体、18-三体、13-三体和总高风险率分别是0.54%、0.21%、0.09%和1.08%；王德刚等[8]对4 271例孕妇进行NIPT筛查，总高风险率是1.83%；段红蕾等[9]对13 041例孕妇进行NIPT检测，结果发现21-三体、18-三体、13-三体和性染色体高风险率分别是0.67%，0.15%，0.07%和0.49%。本研究发现湖北地区孕妇21-三体、18-三体、13-三体、性染色体异常和其余染色体异常高风险率分别是0.33%，0.11%，0.10%，0.38%和0.32%[7-9]，NIPT筛查胎儿非整倍体的总高风险率为1.24%，结果与之前的结果类似。笔者发现湖北各地区的NIPT检测结果不具有差异性，湖北地区染色体非整倍体异常分布均一。

在国家卫计委发布的《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》中，明确孕妇高龄(≥35岁)为NIPT慎用指标，但是在临床研究中发现，近些年来高龄产妇占产前诊断的主导地位，其中21-三体、18-三体、13-三体、性染色体异常占所有染色体异常的90%以上[10]。在本研究发现，高龄(≥35岁)指征会带来孕妇21-三体、18-三体、其余染色体异常和总高风险率显著上升；其中21三体高风险率从0.20%上升为0.74%，18三体高风险率由0.07%上升为0.25%，其余染色体高风险率由0.25%上升为0.54%，胎儿染色体非整倍体高风险概率由0.91%上升为2.27%。在高龄指征下，NIPT对胎儿染色体非整体异常检测性能良好。此外，不良孕产史也是影响胎儿染色体非整体异常的指征之一，具有不良孕产史孕妇的21-三体、18-三体、性染色体异常、其余染色体异常和总高风险率显著升高，其中21三体高风险率由0.25%上升为0.54%，18三体高风险率由0.06%上升为0.25%，性染色体高风险率由0.28%上升为0.61%，其余染色体高风险率由0.19%上升为0.64%，胎儿染色体非整倍体高风险概率由0.85%上升为2.22%，提示具有高龄和不良孕产史的孕妇应该行NIPT筛查。

本研究中NIPT对胎儿染色体非整倍体异常检测的检出率为100.00%，特异度在99%以上，均优于传统的血清学筛查和超声筛查，可以极大地减少漏诊和介入性产前诊断[9,12]。研究发现21-三体、18-三体、13-三体、性染色体异常和其余染色体异常的阳性预测值分别是95.8%，85.7%，62.5%，53.8%和33.3%，与之前的研究结果一致，21-三体、18-三体的阳性预测值较高，13-三体、性染色体异常和其余染色体异常的阳性预测值显著下降，提示NIPT对21-三体、18-三体的检测假阳性率低，对于13-三体、性染色体异常和其余染色体异常假阳性率高，在遗传咨询中应该予以注意。

NIPT检测的对象是母体的外周血的游离DNA(cfDNA)，通过高通量测序和生物信息学计算分析其中胎儿游离DNA(cffDNA)比例[13]，评价胎儿染色体非整倍体异常。cffDNA主要来源于胎盘滋养层细胞，胎儿胎盘嵌合体会导致NIPT出现假阳性[14]及假阴性[15]，NIPT仅反映滋养层细胞的核型，而不是胎儿核型，当出现嵌合体时可能出现与胎儿核型结果不一致的情况，应进行介入性产前诊断。此外，母体染色体异常也会影响NIPT的结果，现有的NIPT检测未将母体的cfDNA分离，若出现母体染色体异常，会影响NIPT结果判读。母体染色体拷贝数异常[16]、非整倍体、嵌合以及孕期肿瘤[17]，由于母体cfDNA异常，会导致NIPT出现假阳性或假阴性结果。在遗传咨询中应明确NIPT是一项筛查技术而非诊断技术，存在其方法的局限性，需要充分结合胎儿超声结果综合考虑，必要时选择介入性产前诊断帮助确诊。

4 结论

高龄和不良孕产史是湖北地区孕妇NIPT高风险的危险因素， 21-三体和18-三体具有较高的阳性预测值，但是13-三体、性染色体异常和其余染色体异常的阳性预测值较低，均表明NIPT是一项筛查技术，高风险孕妇仍需要进行介入性产前诊断确诊；低风险孕妇也应该重视包括超声学在内的其他孕期检查，用以弥补NIPT的局限性。在临床应用中，应结合孕妇的个人情况，充分告知孕妇NIPT的检测范围和局限性，根据临床需要合理应用。