白细胞介素23在子宫内膜息肉中的表达及临床意义*

2019-10-08黄谙非刘勇军谢小军

国际检验医学杂志 2019年18期

周宁，富饶，黄谙非，刘勇军，谢小军△

(南方科技大学医院：1.检验科；2.病理科，广东深圳 518028；3.广东医科大学基础医学院生化教研室，广东东莞 523808)

子宫内膜息肉(EP)是女性常见的妇科疾病之一，有文献报道在人群中的发病率约为7.8%～34.9%，其起源于基底层细胞的良性局限性增生，主要由纤维化的间质、厚壁血管和囊样扩张的腺体组成[1]。子宫内膜息肉可导致阴道异常出血、月经不规律、不孕，甚至国外研究报道子宫内膜息肉的恶变率高达5.6%[2]，但其发病机制尤其是分子生物学的机制依然知之甚少。近年来研究发现子宫内膜息肉的发生与炎症存在相关性，但国内外对子宫内膜息肉的发生与炎症因子异常表达是否有关的研究报道较少，IL23是一个炎性细胞因子，IL23的异常表达与多种疾病的发生、发展存在密切联系，越来越多的证据表明IL23参与了鼻息肉、胃肠道息肉等多种组织的炎症过程，但在子宫内膜息肉中IL23与其是否也存在相关关系至今未见相关报道[3]。为此，本研究通过检测IL23在子宫内膜息肉中的表达及分析IL23与患者各临床病理参数之间的关系，探索子宫内膜息肉发生发病的机制，以期为临床的诊断和治疗提供进一步的理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2016年4月至2018年4月于南方科技大学医院妇产科收治的患者，宫腔镜下切除并经病理学检查确诊为子宫内膜息肉组织共60例，同一患者经病理确诊为正常子宫内膜组织共48例。以上患者手术前3个月内没有接受过任何激素类药物治疗，且不患其他妇科相关疾病如子宫肌瘤、子宫腺肌症等。收集以上标本时，均经过患者本人同意并签署知情同意书。以上患者的临床病理信息如患者年龄、阴道不规则出血、阴道分泌物检查情况、孕次、产次、息肉直径、息肉位置等收集于住院时记录的病历。

1.2方法

1.2.1标本制作标本用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋制作切片，HE染色核实病理诊断。

1.2.2免疫组化染色石蜡切片60 ℃烤1 h，二甲苯脱蜡后再梯度乙醇脱水，置入枸橼酸钠溶液中进行抗原修复，浸入3%H2O2以消除过氧化物酶的活性，用羊血清封闭30 min后用IL23的Ⅰ抗室温孵育30 min(博奥森公司)，PBS洗涤3次，室温下加Ⅱ抗孵育，DAB溶液显色，苏木素溶液复染，然后风化、返蓝、脱水、透明，最后封片。每次实验均在同样的条件下进行，以PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照。

1.2.3免疫组化的结果评分标准免疫组织化学染色结果由两位经验丰富的病理科医生在双盲条件下采用半定量免疫反应评分系统进行评定，并对不一致的结果重新判断直至判定的结果统一。综合染色强度和染色面积进行结果判断，染色强度的评分标准为：0分为不着色，1分为淡棕黄色，3分为深棕黄色，2分为介于两者之间。每张切片随机抽取4个高倍视野，计算染色面积，染色面积评分标准为：0分为<10%，1分为10%～<40%，2分为40%～70%，3分为>70%。两种评分的乘积即为阳性强度，范围为0～9，当评分≥3为表达阳性，评分<3为表达减弱或阴性[3]。

1.2.4蛋白印迹实验随机选取宫腔镜下切除的3例子宫内膜息肉组织为实验组，同一患者诊刮下来的正常子宫内膜为对照组，抽提蛋白，进行蛋白印迹实验。在约30 mg子宫内膜组织中加入300 μL RIPA裂解液，在研钵中充分研磨，按照说明书提取总蛋白并进行蛋白浓度的测定。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转到PVDF膜，脱脂牛奶封闭1 h，4 ℃冰箱Ⅰ抗孵育过夜(Abcam公司)，PBST洗涤3次，加Ⅱ抗，室温孵育1 h，PBST漂洗3次，采用底物化学发光，用化学发光成像分析仪检测目的条带。

1.3统计学处理采用SPSS22.0进行统计学分析，计量资料采用独立样本t检验，计数资料采用构成比表示，两组间比较采用χ2检验，IL23与患者各临床病理参数之间的相关性采用Pearson相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1IL23蛋白在子宫内膜息肉和正常子宫内膜的表达免疫组化的结果显示IL23蛋白表达主要定位于子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的细胞质中，呈棕黄色颗粒。IL23蛋白在正常子宫内膜组中的阳性表达率明显高于子宫内膜息肉组，差异有统计学意义(71.7%vs. 28.3%，P<0.001)，见表1、图1。

表1 IL23蛋白在正常子宫内膜组和子宫内膜息肉组中的表达[n(%)]

注：A和B表示正常子宫内膜组织中IL23阳性表达(×200、×400)；C和D表示子宫内膜息肉组织中IL23阴性表达(×200、 ×400)

蛋白印迹实验结果表明IL23在子宫内膜息肉组中的表达水平较正常子宫内膜组水平下降，差异有显著性(P<0.05)，与免疫组化染色结果一致，见图2。

2.2子宫内膜息肉中IL23的表达与患者各临床病理参数的关系阴道分泌物镜检异常包括检出滴虫、真菌、线索细胞和白带清洁度为Ⅲ或Ⅳ度；患者阴道异常出血表现为经期延长或缩短、经量增多、不规则阴道流血、痛经、绝经后阴道出血等。经Pearson相关性分析比较IL23与患者各临床病理参数之间的关系，结果发现 IL23表达水平与阴道分泌物镜检异常(68.33%vs. 31.67%,r=-0.298，P=0.035)和阴道不规则出血成负相关(63.93%vs. 36.07%，r=-0.258，P<0.05),但其与患者年龄、孕次、产次、子宫内膜息肉位置、息肉直径和息肉个数均无显著的相关性(P>0.05)，见表2。

注：A为使用蛋白印迹实验检测GAPDH和IL23蛋白水平；B 为使用Image J 灰度分析软件评估正常子内膜组和子宫内膜息肉组中IL23/GAPDH比值

表2 子宫内膜息肉中IL23表达及其与各临床病理参数的关系(n)

3 讨论

子宫内膜息肉是妇科常见疾病，其可因使受精卵着床失败而引起不孕，研究发现多发性息肉比单发息肉患者经宫腔镜切除后复发风险更高，甚至其可过度增生至恶变，因此探索子宫内膜息肉发病机制对提高其检出率和治疗效果至关重要[4]。实验首次证实了IL23在子宫内膜息肉中表达下调，且表达水平下调的IL23更常见于阴道分泌物镜检异常和不规则阴道流血的患者。

目前已知与子宫内膜息肉发病机制密切相关的因子有：胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子等[5-6]。LOPES等[7]研究证实雌激素和孕激素受体在子宫内膜息肉中表达水平比正常内膜组织升高。在以往的研究中，虽发现子宫内膜息肉与炎症之间存在相关关系，子宫内膜息肉患者同时存在子宫内膜炎显著性增加，但子宫内膜息肉患者与炎症因子之间的相关关系未见相关研究报道，具体的分子机制仍不明确。IL23是近年来研究较多的炎症因子之一，其与息肉的研究主要集中于鼻息肉、鼻窦息肉、宫颈息肉和肠息肉等，而子宫内膜息肉与IL23蛋白之间的关系未知[3,8-9]。

IL23是IL12家族中新发现的一个异源二聚体细胞因子，由p19和p40两个亚基组成，其中，p40与IL-12中的p40具有同源性，人活化的树突细胞、巨噬细胞、T细胞和内皮细胞都能产生IL-23[10-11]。此研究通过免疫组化实验发现子宫内膜的腺上皮细胞和间质细胞的细胞质也被染成棕黄色，表明子宫内膜的腺细胞和间质细胞也能产生IL23，但其具体产生机制需要进一步的研究。IL23是炎性细胞因子，参与了关节、鼻、鼻窦、子宫颈和肠道等多种组织的慢性炎性反应，并在局部组织重塑过程中起重要作用[12-13]。丁国臣等研究发现IL23p19mRNA在鼻息肉中表达水平明显高于鼻甲黏膜组织[8]。基因微阵列发现IL23p40DNA在宫颈息肉和宫颈内膜中存在差异，蛋白印迹方法进一步验证了宫颈息肉中IL23p40表达水平较正常组升高[9]。从骨关节炎患者体内分离的滑膜细胞在体外培养，发现阻断IL23可以抑制促炎因子TNF-α、IL-1B、和IL6的产生[14]。与野生型小鼠相比，IL-23p19缺失的小鼠慢性肠道炎症性疾病的发病率降低。Kaiqa T在体外实验中研究发现IL23通过Th1细胞能够增强宿主对病原微生物的免疫性和防御能力。研究报道IL-23的主要生物学功能是调解新的CD4+T细胞(Th17细胞)产生IL-17，形成IL-23/IL-17轴而在慢性炎性反应性疾病中发挥重要作用[15]。IL17在抗炎抗肿瘤免疫中是一把双刃剑，其既可以通过促进血管的生成和增加细胞免疫逃逸功能促进肿瘤的生长，也可以通过招募中心粒细胞、NK细胞和CD4+和CD8+T细胞到肿瘤组织而发挥抗炎抗肿瘤的作用[16]。有研究发现IL17和抗炎症细胞因子IL37之间存在相关关系，在子宫内膜异位症中IL37过度表达可以减少炎性相关因子的表达如IL-1B、IL6、IL10，甚至可以抑制子宫基质细胞的增殖、黏附、迁移、侵入及MMP-2和PPP-9的活性[17]。而本研究发现在子宫内膜息肉中IL23表达下调，表明IL23在子宫内膜息肉中可能发挥了抗炎症抗息肉形成的作用。综上所述，IL23在子宫内膜息肉中是否通过IL17而发挥抗炎症抗息肉的作用机制有待进一步的研究与确定。

国外研究发现用ELISA法检测念珠菌阴道炎患者阴道分泌物中 IL23p19的水平，结果显示阴道念珠菌病患者的IL23p19表达水平显著低于正常组，表明念珠菌属真菌感染阴道可能使IL23分泌减少，IL23在念珠菌病阴道炎中可能起了保护的作用[18]。研究结果发现IL23的表达与阴道分泌物镜检异常存在负相关，是否念珠菌等病原微生物所致阴道炎可能逆行上行至子宫内膜，不断炎症刺激使IL23表达下调，刺激子宫内膜组织不断增生导致息肉的形成，但其具体作用机制有待进一步的研究。子宫内膜息肉最常见的临床症状为阴道不规则流血，也是患者就诊最常见的原因，本研究发现在子宫内膜息肉患者中IL23表达在阴道不规则流血和阴道未发生不规则流血建有差异，但具体机制不明，有待将来研究的进一步阐明。