长白山区核桃青皮多糖分离纯化、鉴定及抗氧化活性分析

谢东雪，陆 娟*，王 月，王超雪，陈瑞战，高佳欣

（长春师范大学化学学院，吉林 长春 130032）

核桃（Juglans regiaL.）青皮是核桃未成熟的果皮[1-2]，核桃收获期间会得到大量的核桃青皮，但是往往核桃青皮会被作为废弃材料处理[3]，造成资源的浪费。核桃青皮又称之为青龙衣，在朝鲜、日本及我国，其作为中药被广泛使用，具有清热解毒、止痛，治疗皮肤疾病等作用，同时对癌症的治疗有一定的功效[4-7]，据文献报道，青龙衣中含有醌类、萜类、黄酮及多酚等一些小分子的化合物[8-9]，同时也含有多糖等大分子化合物[10]。

多糖是广泛存在于植物、动物、藻类及微生物中的一类大分子化合物，具有抗氧化[11]、抗肿瘤[12]、免疫调节[13]、降血脂[14]、降血糖[15]等多种生物活性。

本实验以长白山区产的核桃青皮为主要试材，分离纯化超声辅助提取得到的核桃青皮多糖，并对其结构初步鉴定，对获得的均一多糖的体外抗氧化活性进行研究，旨在为更好地开发和利用核桃青皮中的多糖组分及废弃材料的充分利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃青皮是2015年8月采自于吉林省安图县长白山区，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为核桃青皮，晾干后备用。

DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephadex G-100 美国GE Healthcare公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、1,1-二苯基-2-苦味基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪（2,4,6-tripyridyl-strazine，TPTZ）、标准品葡聚糖Dextran系列（分子质量分别为5 000、1.2×104、2.5×104、5.0×104、8.0×104、2.7×105、4.1×105、6.7×105u）、多种标准单糖、VC上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SL-2010N超声波信号发生器（最大功率为1 500 W）南京顺流仪器有限公司；CP-L200-P250中压快速纯化制备系统 科穗科技（苏州）有限公司；TU-1900紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；2695高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配备2998 二极管阵列检测器、2414示差折光检测器） 美国沃特世公司；Nicolet iS50型红外光谱仪赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 JPs的提取

称取核桃青皮粉末200 g，加入20 倍体积的石油醚回流提取2 次，每次2 h，以除去其中色素等脂溶性化合物，滤渣晾干、备用。准确称量醚提取后的核桃青皮样品适量，按照料液比1∶50（g/mL）加入蒸馏水，在室温下浸泡2 h后，利用超声波辅助提取，提取条件[16]为：超声功率900 W、提取时间30 min、温度60 ℃。提取液经离心（5 000 r/min，10 min）、减压浓缩至一定的体积后，加4 倍体积的无水乙醇，静置于4 ℃冰箱24 h醇沉[17]，沉淀经离心（5 000 r/min，15 min）、Sevag法除蛋白[18]，H2O2脱色[19]，利用自来水、蒸馏水各透析24 h后，减压浓缩，冷冻干燥后得到核桃青皮多糖（polysaccharide of walnult green husks，JPs）。

1.3.2 JPs的分离纯化

称取JPs 200 mg，加入少量蒸馏水中溶解，样品溶液离心（5 000 r/min，10 min）以除去不溶物，然后将离心液加样到DEAE Sepharose色谱柱（20 mm×300 mm，10 cm），将色谱柱连接到中压快速纯化制备系统后，分别用蒸馏水及0.1、0.2 mol/L和0.5 mol/L NaCl溶液洗脱，时长240 min，利用试管收集洗脱液（5 mL/管，1 mL/min），用苯酚-硫酸法在490 nm波长处测定洗脱液A值[20]，绘制洗脱管数与A的关系曲线。收集单一对称峰，透析除去NaCl，浓缩后进行冷冻干燥。为了得到足够的多糖样品，重复以上分离操作。

经DEAE Sepharose柱色谱分离得到合适组分，加入2 mL蒸馏水，溶解后利用Sephadex G-100色谱柱（10 mm×250 mm，5 cm）分离，以蒸馏水洗脱，收集样品（5 mL/管，1 mL/min），按照上述方法进行检测、收集及冻干样品，得到纯化后的多糖样品。

1.3.3 JPs分子质量测定

分离纯化得到的JPs分子质量采用高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法测定。色谱条件：Waters Ultrahydrogel 1000（7.8 mm×300 mm，5 μm）、Waters Ultrahydrogel 500（7.8 mm×300 mm，5 μm）、Waters Ultrahydrogel 250（7.8 mm×300 mm，5 μm）3 根GPC色谱柱串联，2695型HPLC仪，2414示差折光检测器，流动相为0.1 mol/L的NaNO3，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，柱温35 ℃。测定方法：取Dextran对照品，超纯水溶解，制成10 mg/mL的对照品溶液，过滤后，在上述色谱条件下进样，记录色谱峰保留时间（tR），以标准分子质量的对数值为纵坐标，以tR为横坐标，绘制标准曲线。样品分别以超纯水制成10 mg/mL的溶液，在同样色谱条件下进样，记录样品保留时间，利用标准曲线计算样品分子质量。

1.3.4 JPs理化性质的测定

JPs总糖含量采用苯酚-硫酸法[21]进行测定，以葡萄糖作为标准品，葡萄糖质量浓度C（mg/mL）与吸光度A之间的标准曲线方程为A=5.341 7C+0.472 7，R2=0.995，线性范围10～90 mg/mL，依据标准曲线测定多糖样品中总糖含量；多糖糖醛酸含量的测定采用硫酸-咔唑法[22]，以葡萄糖糖醛酸作为对照品，标准曲线方程为y=1.242x-0.088，R2=0.996，线性范围10～100 μg/mL，依据标准曲线测定样品中糖醛酸含量；以牛血清白蛋白作为标准对照品，采用考马斯亮蓝法[23]，蛋白质标准曲线方程为y=0.000 6x-0.004 3，R2=0.997，线性范围10～100 μg/mL，依据标准曲线测定多糖中蛋白质的含量。

1.3.5 JPs单糖组成分析

准确称取分离得到的均一多糖样品10 mg置于反应釜中，加入2 mol/L的H2SO42 mL，待样品完全溶解，充氮气、密封置于95 ℃烘箱中水解8 h后，取出反应釜冷却至室温，分别向水解液中加入6 mol/L NaOH溶液使样品呈中性，加超纯水定容至2 mL。分别准确移取上述样品500 μL，加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液和200 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，待样品充分溶解后，充氮气密封，在70 ℃水浴中放置30 min。再分别向样品溶液中加入约150 μL 0.5 mol/L HCl溶液使样品呈中性，然后再分别加入1 mL氯仿萃取，反复萃取3～5 次，弃去氯仿层，上层水溶液过0.45 μm水系滤膜，待HPLC分析。

分别准确称取单糖标准品10 mg，制成5 mg/mL的标准品水溶液，分别取上述标准品溶液200 μL，按照样品的单糖衍生化操作进行HPLC分析。

H P L C色谱条件： Ve n u s i l M P C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相：pH 6.86磷酸缓冲溶液-乙腈（83∶17，V/V），流速0.8 mL/min，检测波长254 nm，柱温35 ℃，进样量10 μL。

1.3.6 JPs红外光谱的测定

称取样品1.5 mg，置于玛瑙研钵中，加入适量干燥KBr粉末，研磨混合，压片后测定红外光谱，扫描范围4 000～400 cm-1。

1.3.7 JPs抗氧化活性分析

JPs总抗氧化能力（ferric-reducing antioxidant power，FRAP）及DPPH、羟自由基清除实验均参照课题组已有方法进行[24]。

2 结果与分析

2.1 JPs提取、分离与纯化

核桃青皮经石油醚除脂、超声波辅助提取、乙醇醇沉、除蛋白、除色素、透析冻干等一系列处理后，得到JPs 15.78 g，提取率为7.89%。

JPs经DEAE Sepharose色谱柱分离，以水和0.1、0.2、0.5 mol/L NaCl溶液洗脱，在水洗和0.1 mol/L NaCl溶液洗脱部分得到2 个明显主峰，洗脱曲线见图1a，分别合并命名为JPs-1、JPs-2。

JPs-1、JPs-2继续经Sephadex G-100色谱柱纯化，洗脱曲线见图1b、c，可以看出JPs-1，JPs-2经纯化后均得到一个对称峰，合并浓缩、透析、冻干得到淡黄色粉末，分别命名为JPs-1-1、JPs-2-1。

2.2 核桃青皮分子质量测定及理化性质

利用HPGPC法测定JPs-1-1、JPs-1-2分子质量，色谱图见图2，根据葡聚糖Dextran系列得到回归方程为：lgmw=-0.154 2tR+9.098 7，R2=0.915。根据保留时间计算出JPs-1-1、JPs-2-1的分子质量为5.45×104、5.22×104u。

图2 JPs-1-1（a）、JPs-1-2（b）的HPGPC色谱图Fig. 2 HPGPC chromatograms of JPs-1-1 (a) and JPs-1-2 (b)

利用苯酚-硫酸法测定JPs-1-1、JPs-2-1的总糖质量分数分别为89.78%、89.46%；利用硫酸-咔唑法测定的其糖醛酸质量分数分别为6.62%、8.82%；蛋白质质量分数测定结果显示，JPs-1-1、JPs-2-1均不含有蛋白质。具体结果见表1。

表1 JPs理化性质Table 1 Physicochemical properties of JPS-1-1 and JPS-2-1

2.3 JPs的单糖组成分析

JPs-1-1、JPs-2-1经2 mol/L的H2SO4水解成单糖，经PMP衍生氯仿萃取后，样品直接进入HPLC进行分析，与标准单糖PMP衍生后的保留时间进行对比，结果见图3、表1，结果表明，JPs-1-1主要是由Rha、GlcA、Gal、Glc、GalA、Xyl和Ara组成，其物质的量比为2.25∶19.26∶2.05∶43.35∶3.36∶21.03∶8.90；JPs-2-1同样是由Rha、GlcA、Gal、Glc、GalA、Xyl和Ara七种单糖组成，物质的量比为1.95∶13.25∶0.97∶32.35∶15.91∶24.73∶10.48；JPs-2-1糖醛酸的含量高于JPs-1-1。

图3 混合标准单糖（a）和JPs-1-1（b）、JPs-2-1（c）酸水解后HPLC图Fig. 3 HPLC chromatograms of mixture of monosaccharide standards (a) and monosaccharides released from acid-hydrolyzed JPS-1-1 (b) and JPS-2-1 (c)

2.4 JPs红外光谱分析

图4 JPS-1-1（a）与JPS-2-1（b）红外光谱图Fig. 4 IR spectra of JPS-1-1 (a) and JPS-2-1 (b)

由图4可知，位于3 380 cm-1附近（3 389、3 400 cm-1）处的吸收峰为O—H伸缩振动，位于2 930 cm-1附近（2 934、2 934 cm-1）处的吸收峰C—H伸缩振动与变角振动，位于1 700 cm-1（1 703、1 714 cm-1）可归属为糖醛酸结构中的C＝O的伸缩振动、1 600 cm-1附近的吸收峰（1 622 、1 618 cm-1）可能是羰基的C＝O伸缩振动，说明该化合物可能含有糖醛酸[25]。位于1 400 cm-1附近的吸收峰（1 448、1 416 cm-1）为C—H的变角振动，位于1 100 cm-1（1 142 cm-1、1 147 cm-1）和1 032 cm-1（1 035、1 071 cm-1）的吸收峰为C—O—C或C—O—H的变角振动[26]，位于879、889 cm-1的吸收峰说明多糖含β-糖苷键[27]。综上，以上吸收峰的存在说明JPs-1-1和JPs-2-1均具有多糖化合物的特征吸收[28]。

2.5 JPs体外抗氧化活性分析

图5 JPs体外抗氧化活性结果Fig. 5 In vitro antioxidant activities of JPs and its fractions

JPs及分离纯化得到的均一多糖JPs-1-1、JPs-2-1具有较强的抗氧化活性。由图5a可以看出，在质量浓度为0.1～3.0 mg/mL范围内，3 种多糖的FRAP值与其质量浓度呈现依赖关系，即随着质量浓度的增加而增加，且JPs增加趋势明显高于JPs-1-1和JPs-2-1，但低于VC。当样品质量浓度为2 mg/mL时，JPs、JPs-1-1、JPs-2-1和VC的FRAP值分别为（955.3±21.2）、（855.6±21.3）、（905.3±19.9）μmol/L和（1 086.5±16.4）μmol/L。JPs多糖FRAP较高的原因可能是未分离纯化多糖中含有多酚、色素等一些具有抗氧化活性的小分子物质。

由图5b可知，在一定质量浓度范围内，样品质量浓度越大，清除能力越强，四者清除能力大小顺序为VC＞JPs＞JPs-1-1＞JPs-2-1，JPs、JPs-1-1、JPs-2-1清除羟自由基的IC50分别为0.23、0.38 mg/mL和0.48 mg/mL。

由图5c可知，在0.1～3.0 mg/mL质量浓度范围内，样品具有较强的清除DPPH自由基的能力。3 种多糖中JPs-2-1清除能力最强，清除DPPH自由基的IC50为0.31 mg/mL，JPs清除能力次之，清除DPPH自由基的IC50为0.32 mg/mL，JPs-1-1清除能力最低，清除DPPH自由基的IC50为0.40 mg/mL。

有研究结果表明多糖的抗氧化活性可能与多糖分子质量有关，分子质量越低，抗氧化活性可能越强；多糖抗氧化活性也可能与多糖的结构有关，如—COOH、—OH等基团的存在也可能增大多糖的抗氧化能力[29]，JPs分离纯化得到的两种均一多糖中，JPs-2-1的抗氧化能力要明显高于JPs-1-1，这可能是由于JPs-2-1的分子质量低于JPs-1-1，且含有较多的糖醛酸。

3 结 论

利用超声波辅助提取法、经过醇沉、除蛋白、除色素、透析、冷冻干燥后得到JPs。JPs先后经DEAE Sepharose、Sephadex G-100柱色谱分离纯化得到JPs-1-1和JPs-2-1两种均一多糖，总糖含量分别为89.78%、89.46%，糖醛酸含量分别为6.62%、8.82%，均不含蛋白质；两种均一多糖均是由Rha、GlcA、Gal、Glc、GalA、Xyl和Ara七种单糖以不同的物质的量比组成，分子质量分别为5.45×104、5.22×104u。体外抗氧化活性结果显示，3 种多糖均具有较强的抗氧化活性，均能清除羟自由基和DPPH自由基，且清除能力与样品质量浓度呈现依赖关系。本研究可为核桃青皮废弃物进一步研究及开发利用提供一定的理论依据。