子实体内麦角固醇光转化VD2平菇菌株筛选与培养

2019-10-08徐明芳陈耕南沈林燕王洋洋黄晓晶

食品科学 2019年18期

徐明芳，陈耕南，沈林燕，王洋洋，李彦，黄晓晶

（暨南大学生命科学技术学院，广东广州 510632）

VD是人类和动物在成长过程中不可或缺的一种维生素，是人体生长发育所需的一种类固醇激素，作为细胞核类固醇家族成员，具有调节人体钙与磷代谢，影响细胞增殖分化，促进骨骼与牙齿的形成，维持血液中氨基酸浓度平衡等作用[1-2]。VD作为固醇类的衍生物，动物体内VD3或胆钙化醇由7-脱氢胆固醇经紫外线照射而转变；VD2或钙化醇则由植物或真菌麦角固醇光转化合成，两种VD在人体内具有相同的生理作用。人体若VD摄取不足，易导致小儿佝偻病、婴儿手足抽搐症、软骨病及老年人骨质疏松。2010年流行病学研究发现，我国老年骨质疏松发病率高于发达国家2 倍以上，90%以上老年人群中VD缺乏严重，目前医学研究还表明VD缺乏还是导致癌症、自发性免疫疾病、传染病、心血管疾病和精神疾病等多发疾病的危险因素[3-6]。

图1 麦角固醇（A）和VD2（B）结构式Fig. 1 Chemical structures of ergosterol (A) and VD2 (B)

麦角固醇是以环戊烷多氢菲（甾核）为骨架的甾醇类化合物，广泛存在于食用菌、酵母等真菌中[7-8]，植物中的麦角固醇除非经过紫外光照射合成VD2，否则很难被人体吸收利用[9-11]，麦角固醇与VD2结构式如图1所示。不同种类食用菌麦角固醇的含量不同，大多数野生或栽培食用菌都富含麦角固醇，麦角固醇是食用菌中含量最高的甾醇，含量最高达食用菌干质量的0.6%～0.7%，占食用菌中所有甾醇含量的83%～89%[12-15]。麦角固醇经紫外光照射时，分子中一个碳环C9和C10发生断裂可转化为VD2，麦角固醇是VD2的前体化合物，是很好的VD2来源，两者为同分异构体[16]（图1）。

天然食物中VD2含量有限，仅存于野生食用菌、酵母等真菌中，在植物和动物中麦角固醇和VD2含量很低[17]。Jasinghe等[18]研究表明，香菇、平菇、双孢菇和鲍鱼菇4 种野生食用菌样品经紫外光照射后，VD2含量随之变化显示差异性，其中平菇中VD2含量最高。我国是食用菌生产和消费大国，产量占世界总产量的70%。平菇由于子实体生长速度快周期短，是食用菌中产量与消费量最高的品种。平菇（Pleurotus ostreatus）属担子菌门（Basidiomycota）、层菌纲（Hymenomycetes）、伞菌目（Agaricales）、侧耳科（Pleurotaceae）、侧耳属（Pleurotus）[19]，富含多糖、多酚等生物活性物质，具有抗氧化[20-22]和降血糖[23-24]等保健功能，目前研究多集中平菇食用菌多糖。麦角固醇是平菇重要的植物甾醇，已引起业界广泛关注，然而，平菇体子实体内麦角固醇光转化为VD2的研究很少。本实验从5 个原种菌株摇瓶筛选高产麦角固醇平菇菌株，通过子实体培养及其体内麦角固醇光促转化为VD2的研究，旨在提高平菇的药食价值，为富含维生素食用菌作为原料开发特膳功能食品的研究提供理论支持，具有重要的现实意义及广泛应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验菌种（编号为P10、P40、PL-39、P831、沙白等5 个平菇菌株）广东省微生物研究所菌种保藏中心。

麦角固醇标准品、VD2标准品、VB1美国Sigma公司；磷酸二氢钾（KH2PO4）、无水乙醇、氢氧化钠（NaOH）、磷酸二氢钠、硝酸铵广州化学试剂厂；麦芽糖、乳糖、麸皮、尿素美国Amresco公司；蛋白胨、酵母粉英国Oxoid公司；葡萄糖、蔗糖、硫酸镁（MgSO4）、石油醚、戊二醛、磷酸氢二钠、四氧化锇、乙酸异戊酯天津市大茂化学试剂厂；化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1100高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪及数据处理平台美国Agilent公司；HPLC柱COSMOSIL 5C18-MS-II（4.6 mm×250 mm，5 μm）上海普誉科贸有限公司；Ultra 55 FESEM场发射电子显微镜德国Zeiss公司；Leica EM CPD300CO2全自动临界点干燥仪德国Leica公司；SCD 005 Sputter Coater离子溅射仪、UV-1750紫外分光光度计日本津岛仪器公司；Thermo Scientific超纯水仪美国Thermo公司；RE-2000B旋转蒸发仪上海亚荣生化有限公司。

1.3 方法

1.3.1 平菇菌丝体与子实体培养方法

1.3.1.1 平菇菌种活化

菌种活化固体培养基（PDA培养基）：马铃薯200 g去皮煮汁，加入葡萄糖20 g、KH2PO41 g、MgSO41.5 g、琼脂粉20 g、VB10.01 g、水1 000 mL。

保藏菌种用接种环接种于PDA培养基中，25 ℃恒温培养7 d后，菌株菌丝洁白浓密、菌丝爬壁力强及生长健壮，可作为种子用于后续摇瓶培养。

1.3.1.2 母种制备与种子摇瓶培养

母种制备与种子摇瓶培养基：马铃薯200 g去皮煮汁，加入葡萄糖20 g、大豆粉2 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、VB10.01 g、水1 000 mL，常规分装，121 ℃高压灭菌30 min。

母种制备：从PDA培养基中切取洁白健壮的菌丝于250 mL装有100 mL液体培养基的三角锥瓶中，菌丝生长最适温度25 ℃，150 r/min恒温振荡培养6 d，作为母种待用。

子实体接种种子制备：从母种中抽取10%接种于500 mL装有200 mL液体培养基的三角锥瓶中，25 ℃，150 r/min振荡培养6～7 d，作为子实体接种种子待用。

1.3.1.3 平菇子实体培养

将称取好的栽培料200 g（其中棉籽壳86%、麸皮10%、石膏2%、石灰2%）加入适量的水（含水量控制约65%）搅拌均匀装袋，120 ℃、高压灭菌2 h；冷却后无菌接种，控制温度22 ℃培养40～60 d，菌丝长满栽培袋后分化出菇形成子实体。

1.3.2 细胞干质量法测定平菇菌丝体生物量[25]

发酵液过滤后，菌丝体用超纯水充分洗涤，50 ℃干燥至恒质量，电子天平准确称质量，按下式计算生物量：

式中：m为细胞干质量/mg；V为取样体积/L。

1.3.3 样品中麦角固醇与VD2的提取方法

样品干燥后碾磨成粉末，取0.1 g于磨口圆底烧瓶中，加入25 mL 15% NaOH溶液、50 mL无水乙醇及4 mL含抗坏血酸钠的NaOH溶液（17.5 g抗坏血酸钠溶于100 mL 1 mol/L的NaOH溶液），85 ℃水浴加热1.5 h，冷却至室温，加入25 mL石油醚，剧烈振荡，静置分层，取上清液，复提下层2 次，合并上清液。上清液中加入5 g无水硫酸钠，过滤。滤液置于45 ℃的旋转蒸发仪中，经3～4 h蒸至近干，乙醇定容至5 mL，0.45 μm滤膜过滤，上样待测。

1.3.4 HPLC检测麦角固醇与VD2含量

采用HPLC法同步测定实验样品中麦角固醇及VD2的含量。HPLC的分离条件：色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-II（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：100%甲醇；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL；柱温：30 ℃；二极管阵列检测器，检测波长：270 nm。

准确量取麦角固醇、VD2标准品，用无水乙醇稀释成一系列浓度的混合标准溶液待测，以麦角固醇、VD2浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标制成标准曲线。计算麦角固醇的标准曲线为y=6.576 6x-15.937，R2=0.999；VD2标准曲线为y=6.207x+17.481，相关系数R2= 0.999 6。

由HPLC法测定得到峰面积，根据标准曲线换算得到样品中麦角固醇、VD2浓度，其含量计算公式如下：

式中：c1、c2分别为麦角固醇、VD2的质量浓度；V1、V2分别为麦角固醇、VD2的定容体积；N1、N2分别为麦角固醇、VD2的稀释倍数；m1、m2分别为萃取麦角固醇、VD2样品的干质量。

1.3.5 菌丝体摇瓶培养基优化实验设计

1.3.5.1 Plackett-Burman试验设计

采用Plackett-Burman试验设计进行显著因素的筛选，对葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、蔗糖（C）、黄豆粉（E）、MgSO4（G）、KH2PO4（H）和VB1（I）7 个因素和2 个虚拟变量[26-28]进行Plackett-Burman试验设计。每个因素取2 个水平，高水平（1）、低水平（-1），以平菇菌丝体麦角固醇含量（mg/g）为响应值。各因素与水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Levels and factors used for Plackett-Burman design

1.3.5.2 最陡爬坡试验方法

根据Plackett-Burman试验结果中以显著因素的效应大小确定最陡爬坡试验的方向和梯度，为后续Box-Behnken试验确定中心点数据。

1.3.5.3 Box-Behnken响应面试验优化

根据Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验中确定的显著因素和中心点，采用Box-Behnken法进行3因素3水平的响应面优化，以获取最佳培养基配方，各因素水平设置见表2。

表2 Box-Behnken试验因素与水平Table 2 Levels and factors used for Box-Behnken design

1.3.6 子实体培养基优化实验方法

每袋200 g子实体栽培培养基中（1.3.1.4节）分别调整葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、豆粉、蛋白胨、KNO3、尿素等组分优化子实体栽培培养基，优势菌株接种后经40 d左右培养分化出菇，分别采集成熟子实体，在60 ℃烘箱中烘干至恒质量，以实体干质量作为子实体生物量，并测定麦角固醇含量。

1.3.7 平菇子实体紫外光照实验方法

紫外灯（管长60 cm、功率30 W、波长254 nm、光照强度0.45 mW/cm2）固定于自行设计的光照培养箱架子上，受试物垂直照射距离设置40 cm。选取子实体发育完全、菌盖未开伞平菇子实体，分离的菌盖菌褶与菌柄在不同照射时间下进行紫外光照实验，非照射处理为对照组，实验重复3 次。

1.3.8 平菇子实体微观结构电镜分析

蒸馏水洗涤样品3 次，4%戊二醛固定液中固定48 h，0.2 mol/L磷酸缓冲液漂洗3 次，1%四氧化锇固定2 h，乙醇梯度脱水（分别为30%、50%、70%、85%、90%乙醇各1 次，100%乙醇2 次，15 min/次），乙酸异戊酯置换乙醇2 次（20 min/次），8 000 r/min离心5 min。制备样品置于CO2临界点干燥仪中干燥，离子溅射仪内完成80 s喷金处理，采用FEM场发射扫描电子显微镜分析样品的微观结构特征。

1.4 数据处理与分析

采用Design Expert 8.0软件对所得数据进行分析，Origin 8.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 HPLC法同步检测麦角固醇与VD2技术方法建立

优化了检测波长（265、270、280 nm）、流动相（甲醇-水比例）、柱温（25、30、35、40 ℃）和流动相流速（0.5～1.2 mL/min）。当最佳分离条件确立为波长270 nm、100%甲醇、柱温30 ℃、流速1 mL/min、进样量5 μL时，色谱图中麦角固醇与VD2单标与混标色谱峰实现完全分离（图2），峰形尖锐对称，保留时间稳定，图谱基线平稳，所有样品在15 min内检测完毕。

图2 VD2、麦角固醇单标（A）和混合标准溶液（B）HPLC色谱图Fig. 2 HPLC chromatograms of vitamin D2 and ergosterol standards

配制6 份相同浓度的标准麦角固醇、VD2混合溶液在上述优化色谱条件下分别进样检测，按照测量值和真实值计算回收率，考察该检测方法的精密度，结果见表3所示。样品麦角固醇、VD2平均回收率分别为99.06%与97.77%；相对标准偏差分别为2.93%与5.54%。

表3 麦角固醇与VD2的加标回收率Table 3 Recoveries of ergosterol and VD2 from spiked samples

如图3A所示，标准品麦角固醇与VD2分别在13.5、10.4 min出峰，峰形尖锐对称，基线平稳无干扰。

图3 麦角固醇与VD2标准品（A）、平菇样品（B）HPLC谱图Fig. 3 Chromatograms of standard solutions (A) and P. ostreatus sample (B)

如图3B所示，平菇样液中麦角固醇与VD2分别在13.3、10.4 min出峰，峰后有少许杂峰但不影响麦角固醇与VD2的定性定量分析，与图3A相比。平菇样品与标准品相应的位置上有相同的色谱峰，主峰与其他色谱峰之间分离关系良好，表明检测体系系统适用性较好，可作为同步检测平菇麦角固醇与VD2含量的关键技术方法。

2.2 高产麦角固醇平菇优势菌株的筛选

2.2.1 菌丝体的生物量与麦角固醇含量差异性

表4 5 种不同菌株菌丝体的生物量及麦角固醇含量Table 4 Mycelial biomass and ergosterol content of fi ve different strains of P. ostreatus

从表4可看出，5 种平菇菌丝体生物量和麦角固醇含量差异较大，P831和P40菌丝体生物量较高，分别超出均值的20.4%、37.7%，尤其是P831麦角固醇含量可达3.25 mg/g，高于其他菌株1.0～3.0 倍，说明不同菌株对麦角固醇含量影响较大[23]，P831确定为优选菌株。

2.2.2 子实体生物量与麦角固醇含量差异性

5 株菌株子实体生物量和麦角固醇含量差异性也较大，结果如表5所示，与平菇P10、P40、PL-39及沙白菌株相比，P831子实体中麦角固醇含量最高，可达到2.05 mg/g。

表5 5 种不同菌株子实体的生物量及麦角固醇含量Table 5 Fruit body biomass and ergosterol content of fi ve different strains of P. ostreatus

P40虽然生长快子实体生物量最高，但其菌丝体与子实体麦角固醇差异较大，由于菌丝体与子实体培养时间约60 d，基于P831在菌丝体与子实体培养中显示的稳定性最终确定为优选菌株。

2.3 平菇菌丝体培养基成分响应面法优化

2.3.1 单因素对菌丝体生物量及麦角固醇含量影响

菌丝体发酵培养基中，碳、氮源是关键成分，碳、氮源是菌体维持细胞生命活动所需的物质，提供细胞能源及各种代谢产物的骨架，构成生物体蛋白质、核酸与甾醇等代谢物的材料，对于菌丝体生物量及麦角固醇含量具有较大的影响。不同碳、氮源对平菇菌丝体产麦角固醇的影响结果如图4所示，其中蔗糖、蛋白胨对菌丝体麦角固醇含量的影响最大，因此，选择蔗糖、蛋白胨作为高产麦角固醇的碳、氮源。

图4 不同碳源（A）、氮源（B）对平菇菌丝体生物量及麦角固醇含量的影响Fig. 4 Effects of different carbon sources (A) and nitrogen sources (B)on mycelial biomass and ergosterol content of P. ostreatus

2.3.2 响应面分析法优化平菇菌丝体培养基成分

由表6、7可知，对平菇菌丝体麦角固醇含量具有显著影响的组分是蛋白胨、KH2PO4、蔗糖（P＜0.05），而MgSO4、VB1对平菇菌丝体麦角固醇含量影响具有负效应，确定蛋白胨、KH2PO4及蔗糖为3 个关键影响因素。

表6 Plackett-Burman试验设计和结果Table 6 Experimental results of Plackett-Burman design

表7 Plackett-Burman试验因素及显著性分析Table 7 Signi fi cance test of Plackett-Burman design

根据Plackett-Burman试验结果，对具有正效应的3 个显著因素蛋白胨、蔗糖、KH2PO4设计最陡爬坡试验，确定菌丝体产麦角固醇液体培养基中关键因素的浓度水平。如表8所示，当蛋白胨0.35%、蔗糖3.48%、KH2PO40.35%时，麦角固醇最大响应值为3.324 mg/g。

表8 最陡爬坡试验设计及结果Table 8 Experimental results of steepest ascent path design

根据最陡爬坡试验结果，以麦角固醇含量为响应变量Y，以蛋白胨质量分数0.35%（X1）、蔗糖质量分数3.5%（X2）、KH2PO4质量分数0.35%（X3）为Box-Behnken设计的中心点，进行3因素3水平的Box-Behnken设计试验，优化菌丝体高产麦角固醇液体培养基组分。不同液体培养基组成对菌丝体麦角固醇含量的影响结果如表9所示。

对表9中菌丝体麦角固醇含量进行回归分析，以麦角固醇含量为响应变量Y，以蛋白胨质量分数（X1）、蔗糖质量分数（X2）、KH2PO4质量分数（X3）为自变量X的二次多项回归方程：

Y=3.53-0.055X1-0.018X2-0.011X3+0.26X1X2+0.079X1X3-0.045X2X3-0.45X12-0.45X22-0.56X32

由表10方差分析结果可知，二元回归模型具有极显著性（P＜0.01极显著），失拟误差P=0.023 7（P＜0.05显著），回归方程和拟合度置信度均较高。

表9 Box-Behnken试验设计及结果Table 9 Experimental results of Box-Behnken design

表10 回归模型的方差分析Table 10 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

通过对回归模型分析知，响应面法优化平菇P831菌丝体产麦角固醇的培养基最佳配比为蛋白胨0.35%，蔗糖3.48%，KH2PO40.35%。在此条件下，模型预测平菇菌丝体中麦角固醇含量达3.53 mg/g, 而实测值为3.64 mg/g，相对误差为2.995%，验证了响应面法预测模型所得结果的可靠性，表明在此条件下该模型具有可预测性。

2.4 栽培料中碳、氮源对子实体生物量与麦角固醇含量的影响

每袋200 g子实体栽培料中，不同碳、氮源量对子实体生物量与麦角固醇含量的影响如图5所示，与对照组（CK）相比，添加了KNO3、葡萄糖、豆粉、尿素的培养基有利于子实体的生长，其中KNO3对子实体产生物量影响最大，而当栽培料中添加蛋白胨、麦芽糖时，子实体生物量相对较低（图5A）。

图5 栽培料对子实体生物量（A）与麦角固醇含量（B）的影响Fig. 5 Effects of different medium components on biomass and ergosterol content of fruit body

由图5B可知，添加尿素、蔗糖与豆粉的培养基可增加子实体中麦角固醇的含量，其中尿素影响最大，此时麦角固醇含量最高达3.81 mg/g，而蛋白胨、葡萄糖、KNO3、麦芽糖对子实体麦角固醇的含量影响不大。

2.5 平菇子实体内麦角固醇光转化VD2

子实体是平菇的繁殖器官，基本结构由菌盖菌褶与菌柄组成。对平菇子实体不同部位经紫外光照射处理，菌盖菌褶与菌柄中麦角固醇与VD2含量结果如表11所示。

表11 平菇不同部位麦角固醇光化VD2含量差异性Table 11 Ergosterol and vitimin D2 contents in different fruit body parts of P. ostreatus

平菇未经紫外照射的情况下，菌盖中麦角固醇含量高于菌柄，此时均未检测到VD2；经过20 min的紫外照射后，菌盖和菌柄中均检测到VD2，其中菌盖中麦角固醇及VD2含量均高于菌柄，虽然菌盖、菌柄中麦角固醇含量变化不明显，但VD2却有显著变化，这与麦角固醇经紫外照射转化为VD2有关[29]。

食用菌体中麦角固醇光促转化为VD2反应机理如图6所示，紫外光照射对麦角固醇光转化VD2有显著影响，麦角固醇是真菌细胞膜中的重要组成成分，共有15 个酶反应参与其生物合成代谢途径[30]，紫外光转化过程中主要产物的相互关系[31]。

图6 麦角固醇紫外光转化VD2示意图[31]Fig. 6 Schematic illustration of UV-induced transformation of ergosterol into VD2

图7 平菇不同部位扫描电镜图Fig. 7 Morphological characteristics of different fruit body tissues of P. ostreatus observed by FESEM

麦角固醇在光催化反应中，除生成有活性的VD2前体和VD2外，长时间的紫外光照，还会生成多种无效价的同分异构体，如光甾醇（L）和速甾醇（T）等副产物[29,32]。但目前尚未发现麦角固醇与VD2含量之间转化的相关性研究。实验证实，光照射时间40 min以上，平菇色泽出现由白向深黄褐的转变，说明子实体组织结构出现光损伤，对于平菇而言，将严重影响其外观。

麦角固醇是真菌细胞膜中的重要组成成分，大量存在于食用菌细胞质膜上，多以自由态存在于真菌细胞膜的磷脂双分子层中。图7电镜结果显示，平菇子实体菌盖中含有大量菌丝体与成喙状突起的锁状结构，菌盖菌褶中致密的菌丝孢子和菌柄中管状纤维网络结构（未见孢子）这两种组织结构存在微观差异性，平菇中麦角固醇与VD2含量从上面菌盖菌褶到下面菌柄呈递减趋势，而平菇食用菌丝体中锁状结构和子实体中孢子是细胞分裂能力、新陈代谢旺盛的主要组织结构，推测麦角固醇与VD2含量与组织形态结构与细胞新陈代谢能力有相关性。