两种常用氯氰菊酯对秀丽隐杆线虫生殖发育影响的信号转导通路

2019-10-08余雪锋耿文敬郭肖颖

农业环境科学学报 2019年9期

余雪锋，耿文敬，郭肖颖，朱江

（1.安徽农业大学资源与环境学院，合肥 230036；2.安徽省农业科学院农业工程研究所，合肥 230031）

氯氰菊酯（Cypermethrin，CPM），是继有机磷、有机氯等农药之后发展起来的一类新型杀虫剂，被广泛应用于棉花、蔬菜、大豆和甜菜等作物害虫的防治[1]。顺式氯氰菊酯（α-CPM）和高效氯氰菊酯（β-CPM）具有杀虫谱广、杀虫效率高、生产成本低和工艺简单等优点，是拟除虫菊酯类杀虫剂中应用范围广、使用量大的菊酯类农药[2-3]。

CPM环境稳定性强，不易被光和空气降解。世界卫生组织将CPM定性为中等毒性，欧盟规定水产品中 CPM 最高残留量为 50 μg·kg-1[4]。Kumari等[5]在印度的棉花-小麦和水稻-小麦轮作田地和甘蔗地检测到CPM残留量为1～35µg·kg-1。宋国春等[6]研究发现青花菜中CPM残留量为0.160～0.397 mg·kg-1。余正萍[7]测定出CPM在四川黄瓜山果园摘取的黄桃、名豪超市购买的梨和永川重百超市购买的苹果残留量为0.009 0～0.017 9 mg·L-1。CPM残留可通过食物链进入人体，危害人体健康[8]。

CPM已被美国环境保护局（U.S.Environmental Protection Agency，USEPA）认定为可疑致癌物[9]。有研究显示，CPM暴露可诱导机体的生殖毒性[4]。Undeger等[10]研究表明200 g·L-1的CPM显著增加人体淋巴细胞DNA损伤。马萍等[11]研究发现β-CPM（≥20 mg·kg-1）造成小鼠神经细胞DNA和脑组织氧化损伤，且有剂量效应。阮秦莉等[12]研究发现将L4期野生型秀丽隐杆线虫暴露于8.0 mg·L-1的CPM 48 h后产卵数目明显降低。Wang等[13]研究表明哺乳期小鼠母体暴露于6.25 mg·kg-1的CPM可导致雄性子代睾丸发育和精子发生长期损害。目前，CPM对机体生殖损伤的相关作用机理鲜有报道，尤其关于CPM作用于机体生殖毒性损伤信号传导途径的研究几乎尚未涉及。基于此，本文以秀丽隐杆线虫作为实验动物，以线虫生殖细胞凋亡、产卵量和卵孵化率作为生物检测终点，开展两种常用氯氰菊酯α-CPM和β-CPM作用于机体的生殖毒性效应，并探索生殖损伤发生的信号转导通路，探讨相关作用机理，为评估α-CPM和β-CPM暴露的健康危害性提供理论研究数据。

1 材料和方法

1.1 线虫品系与培养

N2 Brisitol野生型。

ced-3（mt1522）、ced-4（mt2547），属于 caspase缺失，缺乏生理性细胞凋亡和遗传性诱导的生殖细胞凋亡。

cep-1（jr1279），为p53基因突变，具有生理性细胞凋亡。

hus-1（ws2277）为DNA损伤响应基因突变，具有生理性的生殖细胞凋亡，但缺乏诱导辐射的细胞凋亡和生殖细胞周期停滞。

lin45（mh575）、mek-2（mt8666）、mpk（mh37）均为ERK MAPK信号转导途径的成员。

mkk（cz4213）、jnk（vc8）、jkk（ku2）、mek-1（fk141）均为JNK MAPK信号转导途径的成员。

nsy-1（au3）、sek-1（au1）、pmk（ku25）均为 p38 MAPK信号转导途径的成员。

以上所有线虫品系均由美国NIH资助的国际线虫种质中心（CGC）赠送。将线虫培养于含有大肠杆菌OP50的NGM平板固体培养基（Nematode Growth Medium）上，20℃恒温培养[14]。按照Donkin等[15]的方法同步化，获得大量L4期线虫。

1.2 主要试剂

α-CPM（顺式氯氰菊酯标准品）：CAS NO：[67375-30-8]，产品货号：ZDR-C11890100，中文名：alpha-氯氰菊酯，英文名：alpha-Cypermethrin，规格：0.1 g。分子量为416.30，难溶于水，在醇类、酮类和取代芳烃类有机溶剂中溶解＞450 g·L-1。

β-CPM（高效氯氰菊酯标准品）：CAS NO：[72204-43-4]，产品货号：ZDR-C11890200，中文名：beta-氯氰菊酯，英文名：beta-Cypermethrin，规格：0.1 g。分子量为416.30，难溶于水，在醇类、酮类和取代芳烃类有机溶剂中溶解＞450 g·L-1。

1.3 实验方法

1.3.1 CPM毒性暴露试验

CPM杀虫剂难溶于水，易溶于有机溶剂。实验以纯丙酮溶液作为溶剂，将CPM配制成0.1 g·mL-1的母液。暴露溶液由母液以K-medium为溶剂梯度稀释至 0.005、0.05、0.2、0.8、3.2 mg·L-1浓度，以 K-medium溶液作对照。将L4期线虫接入到不同浓度CPM溶液的Costar 12孔组织培养板，加入2%E.coli OP50浓缩菌作为食物，配制成1 mL的培养液，置于20℃恒温摇床，在24 h后将处理后的线虫取出进行进一步分析。

文章应用线虫生殖细胞死亡、产卵量和卵孵化率作为生物检测终点，研究α-CPM和β-CPM暴露对机体生殖发育的影响。将同步化的L4期线虫或早期成虫暴露于0.005、0.05、0.2、0.8、3.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM染毒培养24 h后，统计其生殖腺的死亡细胞数目、产卵量和卵孵化率。各对照组、暴露组的测定数目为15～20条线虫。

0.005 、0.05、0.2、0.8、3.2 mg·L-1的CPM处理液中的丙酮浓度分别为：0.025、0.25、1、4、16 μL·mL-1，与K-medium对照相比均未出现显著性差异（图1），所以以丙酮为溶剂的CPM处理液中丙酮的浓度不影响线虫生殖细胞凋亡的评价结果。

图1 丙酮暴露诱导的线虫生殖细胞死亡Figure 1 Acetone induced germ cells death in C.elegans

1.3.2 数据统计

所有数据均应用IBM SPSS Statistics 19.0分析，以平均值±标准差的形式表示，以Turkey多重比较检验不同浓度的α-CPM和β-CPM暴露对秀丽隐杆线虫生殖发育的影响。利用双尾t检验同一品系线虫α-CPM和β-CPM不同暴露浓度所导致的细胞凋亡、产卵量和卵孵化率的差异性。

2 结果与分析

2.1 α-CPM和β-CPM暴露诱导线虫的生殖细胞死亡

图2结果显示，暴露于α-CPM的线虫生殖细胞死亡数目在0.005～0.2 mg·L-1范围内呈递增趋势，在0.05 mg·L-1已表现出显著性差异（P＜0.05），并于0.2 mg·L-1达到最大值，而当α-CPM浓度增加至0.2～3.2 mg·L-1范围时，线虫生殖细胞死亡数目与0.2 mg·L-1暴露组相比呈先减少后增加的趋势，且与对照相比均出现显著性差异。暴露于β-CPM的线虫生殖细胞死亡数目的变化趋势与α-CPM基本一致。正常生长发育的线虫，其生殖腺有丝分裂区的细胞排列紧致有序，细胞核大小均匀，而随着α-CPM和β-CPM暴露浓度的增加，这种有序的结构逐渐被破坏，且细胞数量明显减少（图3）。暴露于β-CPM的线虫生殖细胞死亡数目与对照相比出现显著性差异的浓度为0.005 mg·L-1。这一结果说明，以线虫生殖细胞凋亡为检测终点时，β-CPM暴露诱导显著性生殖细胞死亡的浓度低于α-CPM，即β-CPM暴露对机体造成的生殖毒性较α-CPM大。

图2 α-CPM和β-CPM诱导的线虫生殖细胞死亡Figure 2 α-CPM and β-CPM induced germ cells death in C.elegans

较低浓度的α-CPM和β-CPM暴露均诱导线虫发生显著的生殖细胞凋亡，并于0.2 mg·L-1暴露浓度达到最大值，故在之后探究相关作用机理中，均选用0.2 mg·L-1作为供试浓度。

2.2 α-CPM和β-CPM暴露诱导的线虫生殖细胞死亡依赖核心凋亡途径

线虫中，ced-3和ced-4是生殖细胞凋亡的核心调控基因，为明确α-CPM和β-CPM暴露诱导线虫生殖细胞死亡是细胞坏死还是程序性的细胞凋亡，凋亡的细胞呈亮黄色，是DNA片断化的一个重要标志，而未凋亡的细胞呈现均匀的浅绿色（图4），将ced-3和ced-4基因缺陷型的线虫品系ced-3（mt1522）和ced-4（mt2547）暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM进行染毒处理。图5结果显示，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM的ced-3（mt1522）和ced-4（mt2547）线虫，其单个生殖腺臂的生殖细胞死亡数目与对照相比无显著性差异，而以0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM处理的野生型N2线虫品系，其单个生殖腺臂的细胞死亡数目从对照的2.05±0.17分别增加至3.67±0.27和3.76±0.27（P＜0.01）。由于ced-3和ced-4基因是细胞凋亡所必需的，而α-CPM和β-CPM暴露不能使ced-3（mt1522）和ced-4（mt2547）基因缺陷型品系的AO阳性细胞数目增加，表明在野生型N2线虫品系上所检测的AO阳性细胞是凋亡细胞（图5，P＞0.05）。且ced-3突变品系线虫为caspase基因突变，缺乏caspase途径会抑制生理性的生殖细胞凋亡，表明α-CPM和β-CPM诱导的生殖细胞死亡是依赖于ced-3和ced-4基因调控的细胞凋亡。

图3 CPM暴露诱导的线虫生殖腺有丝分裂细胞减少Figure 3 Decreased mitotic germline cells induced by CPM exposure in C.elegans

图4 CPM诱导的线虫细胞凋亡>Figure 4 CPM-induced germline apoptosis in C.elegans

图5 α-CPM和β-CPM诱导的线虫生殖细胞死亡依赖ced-3和ced-4基因的表达Figure 5 α-CPM and β-CPM-induced germ cell death dependent of ced-3 and ced-4 genes in C.elegans

2.3 α-CPM和β-CPM暴露诱导的线虫生殖细胞凋亡不依赖DNA损伤信号通路

为研究α-CPM和β-CPM诱导的生殖细胞凋亡的途径，将基因缺陷型品系cep-1（jr1279）暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM进行染毒处理，24 h后测定其生殖细胞凋亡数目。图6结果显示，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和 β-CPM 的 cep-1（jr1279）线虫品系，其生殖细胞凋亡细胞数目从对照的2.52±0.19分别增加至4.00±0.27和3.90±0.22，其增长趋势与α-CPM和β-CPM染毒处理的野生型N2基本一致（P＜0.05），这一研究结果说明，cep-1基因的功能缺失不影响α-CPM和β-CPM诱导的线虫生殖细胞凋亡，即α-CPM和β-CPM诱导的线虫生殖细胞凋亡不依赖于cep-1的表达。

图6 DNA损伤检测点蛋白HUS-1和响应基因cep-1在α-CPM和β-CPM诱导的生殖细胞凋亡中的作用Figure 6 Roles of checkpoint protein HUS-1 and DDR gene cep-1 in α-CPM and β-CPM-induced germ cell apoptosis

为了研究hus-1基因是否参与调节α-CPM和β-CPM诱导的生殖细胞凋亡，将基因缺陷型品系hus-1（ws2277）暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM进行染毒处理，24 h后线虫生殖细胞凋亡数目显著增加（P＜0.01），图6结果显示，hus-1基因未参与α-CPM和β-CPM诱导的生殖细胞凋亡。综合上述研究结果说明，α-CPM和β-CPM诱导的线虫生殖细胞凋亡不依赖DNA损伤信号通路。

2.4 MAPK信号转导途径在α-CPM和β-CPM诱导的生殖细胞凋亡中的作用

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，MAPK）是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。MAPK有3个主要家族：ERK、JNK和p38 MAPK。文章探索了MAPK信号转导通路在α-CPM和β-CPM诱导的生殖细胞凋亡中的作用。

2.4.1 α-CPM和β-CPM诱导的线虫生殖细胞凋亡不依赖ERK MAPK信号转导途径

在C.elegans中，ERK信号转导途径成员有lin-45（MAPKKK），mek-2（MAPKK）和 mpk-1（MAPK）。将基因敲除的线虫品系lin-45（mh575）、mek-2（mt8666）以及mpk-1（mh37）分别暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM进行染毒处理，图7结果显示，lin-45（mh575）、mek-2（mt8666）以及 mpk-1（mh37）的生理性细胞凋亡数目分别为3.90±0.22、4.58±0.27、3.47±0.25，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM染毒培养24 h后，其细胞凋亡数目分别为 5.13±0.27、5.67±0.25、4.70±0.32，相对值分别为1.23、1.09、1.23，均出现显著性差异（P＜0.01）；暴露于0.2 mg·L-1的β-CPM染毒培养24 h后，其细胞凋亡数目分别为5.21±0.34、6.35±0.31、4.55±0.28，相对值分别为1.31、1.77、1.08，与未处理的自身对照相比亦出现显著性差异（P＜0.01）。比较暴露于α-CPM和β-CPM的野生型N2与lin-45（mh575）、mek-2（mt8666）以及 mpk-1（mh37）的相对值发现，lin-45（mh575）、mek-2（mt8666）以及mpk-1（mh37）增加的幅度基本与野生型N2一致，说明ERK信号转导途径相关基因的突变并未阻止α-CPM和β-CPM诱导的生殖细胞凋亡，也就是说ERK MAPK信号转导途径不是α-CPM和β-CPM诱导线虫生殖细胞凋亡的主要信号转导通路。

图7 ERK MAPK信号转导途径在α-CPM和β-CPM诱导的线虫生殖细胞凋亡中的作用Figure 7 Roles of ERK MAPK signaling pathways in α-CPM and β-CPM-induced germ cell apoptosis

2.4.2 α-CPM和β-CPM诱导的线虫生殖细胞凋亡依赖JNK MAPK信号转导途径

在C.elegans中，JKK-1属于JNK MAPK，MKK-4则是其激活蛋白。MKK-4在线虫中有2个同源蛋白，分别为JKK-1和MEK-1。这些基因的缺失会使C.elegans对环境的胁迫敏感，如重金属暴露和饥饿。将基因缺陷型品系 mek-1（fk171）、jnk-1（vc8）、jkk-1（ku2）和mkk-4（cz4213）暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM染毒处理24 h后观察其生殖细胞的凋亡数目。图8结果显示，mek-1（fk171）、jnk-1（vc8）、jkk-1（ku2）和mkk-4（cz4213）品系中生殖细胞凋亡数目分别为3.52±0.26、3.21±0.18、4.42±0.29个和4.42±0.29个，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM染毒培养24 h后，其细胞凋亡数目分别为2.60±0.17、3.05±0.20、4.52±0.25个和 4.52±0.25 个，jnk-1（vc8）、jkk-1（ku2）和mkk-4（cz4213）品系线虫与自身未处理对照相比均未达到显著性差异（P＞0.05）；暴露于0.2 mg·L-1的β-CPM染毒培养24 h后，mek-1（fk171）、jnk-1（vc8）、jkk-1（ku2）和mkk-4（cz4213）品系中生殖细胞凋亡数目分别为3.35±0.26、2.63±0.17、4.83±0.29个和 4.83±0.29个，mek-1（fk171）、jkk-1（ku2）和 mkk-4（cz4213）与自身未处理对照相比均未达到显著性差异（P＞0.05）。上述研究结果表明，JNK信号转导途径是α-CPM和β-CPM诱导生殖细胞凋亡所需要的。

图8 JNK MAPK信号转导途径在α-CPM和β-CPM诱导的线虫生殖细胞凋亡中的作用Figure 8 Roles of ERK MAPK signaling pathways in α-CPM and β-CPM-induced germ cell apoptosis

2.4.3 α-CPM和β-CPM诱导的线虫生殖细胞凋亡部分依赖p38 MAPK信号转导途径

在C.elegans中，nsy-1编码MAPKKK、SEK-1是MAPKK家族，以及PMK-1是p38 MAPK家族成员之一。将基因敲除品系nsy-1（au3）、sek-1（au1）和pmk（ku25）暴露于0.2 mg·L-1的a-CPM和β-CPM染毒培养24 h，图9结果显示，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM的nsy-1（au3）和sek-1（au1）线虫品系，其生殖细胞凋亡数目分别由2.62±0.26和2.75±0.19上升至3.89±0.29和3.48±0.29（P＜0.05），而在pmk（ku25）品系中，其生殖细胞凋亡数目显著降低（P＜0.05）；暴露于β-CPM的nsy-1（au3）、sek-1（au1）和pmk（ku25）的生殖细胞凋亡数目变化趋势与α-CPM基本一致。综合上述研究结果说明，nsy-1和sek-1基因的缺失不影响a-CPM和β-CPM诱导的生殖细胞凋亡，而pmk基因的功能缺失减少了a-CPM和β-CPM诱导的生殖细胞凋亡数目，该研究结果表明，a-CPM和β-CPM诱导的线虫生殖细胞凋亡部分依赖p38 MAPK信号转导途径。

2.5 α-CPM和β-CPM暴露对线虫产卵量和卵孵化率的影响

图9 p38 MAPK信号转导途径在α-CPM和β-CPM诱导的线虫生殖细胞凋亡中的作用Figure 9 Roles of p38 MAPK signaling pathways in α-CPM and β-CPM-induced germ cell apoptosis

当前已有研究结果显示，CPM暴露可诱导小鼠细胞周期阻滞及DNA损伤，且在接触CPM的农民的淋巴细胞中发现了遗传毒性效应。而本文以生殖细胞凋亡为生物检测终点的结果显示，α-CPM和β-CPM诱导的生殖细胞凋亡不依赖DNA损伤信号通路，为了明确α-CPM和β-CPM暴露是否引起机体的DNA损伤效应，研究了α-CPM和β-CPM暴露对线虫的产卵量和卵孵化率的影响。

线虫成虫体内卵的数目及产卵量代表线虫生育后代的能力，是线虫生殖发育的一个至关重要的指标。将同步化的L4期或早期成虫暴露于0.05、0.2、0.8、3.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM染毒培养24 h后，统计其产卵数目和卵孵化率。图10A结果显示，暴露于α-CPM的线虫产卵量在0.05～3.2 mg·L-1范围内呈递减趋势（P＜0.01），具有剂量效应。暴露于β-CPM的线虫产卵量的变化趋势与α-CPM基本一致（P＜0.01）。图10B结果显示，暴露于α-CPM的线虫卵孵化率在0.05～3.2 mg·L-1范围内呈递减趋势（P＜0.05），具有剂量效应。暴露于β-CPM的线虫卵孵化率的变化趋势与α-CPM基本一致（P＜0.01）。比较野生型N2 α-CPM和β-CPM产卵量和卵孵化率的相对值发现，β-CPM暴露诱导线虫产卵量和卵孵化率的下降幅度较α-CPM大，且在0.05 mg·L-1的β-CPM的线虫卵孵化率已表现出极显著性差异（P＜0.01）。上述结果说明，α-CPM和β-CPM的暴露诱导线虫生殖腺受损，意味着造成机体的DNA损伤，提示它对线虫生殖细胞可能具有遗传毒性作用，β-CPM暴露对机体造成的生殖毒性较α-CPM大，与凋亡实验结果一致。α-CPM和β-CPM暴露诱导线虫DNA损伤的具体作用机理是未来研究的主要方向。

图10 不同浓度α-CPM和β-CPM对线虫产卵量和卵孵化率的影响Figure 10 The effect of different concentration α-CPM and β-CPM on brood size and hatching rate in C.elegans

3 讨论

文献显示，线虫生殖细胞凋亡对外界环境压力非常敏感，已被应用于重金属、辐射等环境健康的评价[16]。线虫的子代数目和卵孵化率反映其繁殖能力，亦是机体响应环境胁迫引起生殖损伤的重要指标。本文以线虫的生殖细胞凋亡、产卵量和卵孵化率作为生物检测终点，0.05 mg·L-1的α-CPM和β-CPM暴露均诱导线虫发生显著的生殖细胞凋亡，在0.005～0.2 mg·L-1范围内较对照组呈递增趋势，暴露于0.8 mg·L-1的α-CPM和β-CPM的线虫生殖细胞死亡数目低于暴露于0.2 mg·L-1浓度组，而在0.8～3.2 mg·L-1范围内较0.8 mg·L-1浓度组呈递增趋势。线虫生殖细胞死亡数目取决于生殖腺有丝分裂区的细胞数量，并随着线虫生殖腺有丝分裂区细胞数的减少而减少[17]，暴露于0.2～0.8 mg·L-1范围内的线虫，其生殖细胞凋亡与0.2 mg·L-1浓度组相比呈减少趋势可能与α-CPM和β-CPM暴露诱导的有丝分裂生殖细胞数量减少有关[18]。

在C.elegans中，CEP-1是哺乳动物肿瘤抑制基因p53的同源蛋白，具有促进DNA损伤引起的细胞凋亡的功能[19]。在遗传损伤条件下，线虫生殖细胞凋亡需要DNA损伤响应cep-1的表达[20]。HUS-1是一个9∶1∶1的复合体，编码了DNA损伤检测点蛋白，是DNA损伤的感受因子[21]。检测点基因突变阻止了由DNA损伤引起的凋亡，而不影响生理性生殖细胞凋亡。而本文进一步研究发现，DNA损伤不是α-CPM和β-CPM暴露诱导线虫生殖细胞凋亡的关键信号通路。而除了DNA依赖性的细胞凋亡途径，环境胁迫还可诱导线虫中非遗传损伤的凋亡信号通路。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，MAPK）是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，属于丝氨酸/酸酸蛋白激酶，可被多种刺激所活化[22]。MAPK 有 3个主要家族：ERK、JNK 和 p38 MAPK，在C.elegans均可找到其同源蛋白，因此，C.elegans亦含有3条主要的MAPK信号转导途径，ERK、JNK和p38 MAPK[23-24]。结果显示α-CPM和β-CPM暴露诱导的线虫生殖细胞凋亡依赖JNK MAPK信号转导途径，部分依赖p38 MAPK信号转导途径，而不依赖ERK MAPK信号转导途径，与低浓度全氟辛烷磺酰基钾盐（PFOS）处理的线虫作用机理相似[25]。

产卵孵化的结果显示暴露于0.05、0.2、0.8、3.2 mg L-1的α-CPM和β-CPM的线虫产生后代的数目减少和卵孵化率降低，意味着造成DNA损伤，对生殖细胞具有潜在的基因毒性作用，与阮秦莉等[12]研究结论相一致，具体的作用机理是未来研究的主要方向。线虫的性腺可能是α-CPM和β-CPM的靶器官，造成线虫生殖系统发育和功能异常，并能通过母体影响子代的发育[26]。其中暴露于β-CPM的产卵量和卵孵化率下降幅度较大，在一定程度上说明β-CPM的生殖毒性更强，与凋亡实验结果一致。本文研究结果可以为α-CPM和β-CPM系统地评估生态风险提供依据。