菊芋种质资源鉴定及DNA指纹图谱的构建

高洁铭，杨世鹏，孙雪梅，王丽慧，李 莉，钟启文*

(1.青海大学，青海 西宁 810016；2.青海大学农林科学院，青海省蔬菜遗传与生理重点实验室，青海 西宁 810016)

【研究意义】菊芋(HelianthustuberosusL.)又称洋姜、鬼子姜，隶属于菊科(Compositae)向日葵属(H.annuusL.)，是一种多年生草本植物，且其块茎中含有丰富的果聚糖[1]。目前，国内对菊芋的研究主要集中在生理生化[2]、果聚糖代谢[1]、生物能源[3]、生态治理[4]和栽培技术[5]等方面。菊芋具有较强的抗逆性能，尤其在抗盐碱、抗旱、抗寒等方面抗性较强，并且因其根系发达具有保持水土等作用，因此成为我国荒漠地区主要的防风固沙作物之一[6]。目前，已经被开发和应用的DNA标记技术有20余种，由于菊芋基因组尚未开发，因此在菊芋这种作物上应用的DNA标记仅4种：随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)[7]、简单重复序列间(inter-simple sequence repeat，ISSR)[7-8]、简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)[9-10]和DNA标记和相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)[11-12]。其中SSR标记不但可以检测到多等位基因位点，并且基于扩增多态性丰富，且PCR技术操作简便、成本较低，已成为当前应用最为广泛的DNA分子标记技术之一[13]。【前人研究进展】目前SSR标记已经在国外普遍应用于向日葵遗传图谱构建和多样性分析，如杂种优势利用和亲缘关系分析[14-16],基于QTL定位的抗逆性育种分析[17-19]及应用于品种的基因分型鉴定[20-21]等。但在国内，分子标记在菊芋种质资源及育种方面的运用都相对欠缺。目前对仅有的报道查阅得出，薛志忠等通过SRAP对58份种质资源进行了遗传多样性分析，由于其可以充分体现各资源间的差异性，因此可作为一种种质鉴定的依据[11]；赵孟良等对43份菊芋种质资源遗传多样性的ISSR进行研究发现，国外菊芋种质资源遗传差异性较大且与国内资源还存在较大的遗传距离[8]。杨世鹏等通过转录组开发的SSR标记对菊芋种植资源进行分析得出，SSR标记为菊芋种质资源选择育种、遗传图谱的构建与多样性分析等提供丰富可靠的标记[9]。【本研究切入点】通过本课题组前期形态学研究得出，菊芋种质资源呈现出丰富的遗传多样性，但其亲缘关系的远近及遗传结构仍不明确，仅仅通过表型差异和地理来源来评价效率较低且不准确，必须使用更加有效地标记方法。目前DNA标记在分子生物学方面应用较广泛，主要包括种质资源选育与研究、关键目标基因定位、标记辅助育种等方面[22]。【拟解决的科学问题】为有效鉴定区分不同菊芋品种，保证品种纯度，更好地促进国内菊芋育种研究，本研究采用SSR、SRAP标记对12份国内品种和8份美国菊芋资源进行指纹图谱构建和遗传亲缘关系分析，旨在为菊芋育种利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

用于数字化DNA指纹图谱构建和亲缘关系分析的材料为本实验室多年来自建4份品种以及收集的8份国内不同地区品种和8份美国菊芋资源(表1)。材料于2018年4月种于青海省农林科学院试验田，在2018年10月菊芋块茎成熟后收集样品置于-80 ℃超低温冰箱中保存，以用于DNA的提取以及后续实验的进行。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取 称取100 mg新鲜菊芋块茎，迅速通过液氮冷冻并充分研磨，使用Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒对其进行DNA的提取；通过1 %的琼脂糖凝胶电泳对提取的总DNA质量进行检测。

1.2.2 SSR、SRAP引物的设计 根据青海省蔬菜遗传与生理重点实验室之前建立的菊芋SSR/SRAP-PCR最佳反应体系，采用北京六合华大基因科技有限公司合成10对SSR、10对SRAP引物组合，对20份菊芋基因组DNA进行扩增，从条带清晰度、亮度和条带数等方面筛选出适合于SSR、SRAP遗传多样性研究的引物序列。

1.2.3 PCR扩增体系选择及毛细管电泳检测 根据本实验室优化的菊芋SSR -PCR、SRAP-SSR最佳反应体系[10-12]，对20分菊芋种质资源进行PCR程序扩增。本试验选用25 μl的PCR反应体系：12.5μl的2×TaqPCR MastreMix, 1 μl的模板DNA，正反引物各1 μl，ddH2O补充至25 μl。PCR反应程序为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，Tm退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环，72 ℃总延伸10 min，4 ℃保存。通过LabChip GxTouch HT仪器，HT DNA 1K Reagent Kit试剂盒对产物进行毛细管电泳检测扩增条带。

表1 供试菊芋材料

1.3 数据处理

使用LabChip GX Reviewer软件分析扩增片段峰型，读取片段数据；数据分析采用Excel进行指纹图谱的结果统计，用“1”表示高位条带，“0”表示低位条带或无条带；使用DPS软件计算各种植资源间的遗传距离，并将遗传距离通过MEGA7.0进行UPGMA聚类分析,最后使用iTOL(https://itol.embl.de/)对树形图进行美化。

2 结果与分析

2.1 多态性条带的筛选

通过毛细管凝胶电泳检测共筛选出7对片段大小介于100～600 bp、条带清晰、多态性和稳定性都比较好的SSR引物，8对片段大小介于100～950 bp条带清晰、多态性和稳定性都比较好的SRAP引物(表2)。引物1770对供试菊芋材料的扩增片段无多态性差异，引物10897对材料的扩增多样性最好(图1～2)。

最高条带为1500 bp UPmarker(UM),最低条带为Low Marker(LM);中间条带为材料扩增条带，供试材料按照从左到右的顺序依次排列The highest band is 1500 bp UPmarker(UM), the lowest band is the low marker(UM); The intermediate band is the material expansion band. The test materials are arranged in order from left to right图1 引物1770在20份菊芋种质资源的SSR扩增电泳图Fig.1 SSR amplification electrophoresis map of primer 1770 in 20 parts of Jerusalem artichoke germplasm resources

最高条带为1500 bp UPmarker(UM),最低条带为Low Marker(LM);中间条带为材料扩增条带，供试材料按照从左到右的顺序依次排列The highest green band is 1500 bp UPmarker(UM), the lowest green band is the low marker(UM); The intermediate band is the material expansion band. The test materials are arranged in order from left to right图2 引物10897在20份菊芋种质资源的SSR扩增电泳图Fig.2 SSR amplification electrophoresis map of primer 10897 in 20 parts of Jerusalem artichoke germplasm resources

表2 15对引物名称及序列

续表2 Continued table 2

引物名称Primer name正向序列F primer反向序列R primer退火温度(℃)TmMe6-Em6TGAGTCCAAACCGGTAGGACTGCGTACGAATTGCA51.9Me9-Em14TGAGTCCAAACCGGTCAGACTGCGTACGAATTCAG51.9Me4-Em5TGAGTCCAAACCGGACCGACTGCGTACGAATTAAC51.2Me3-Em14TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTCAG50.3Me1-Em1TGAGTCCAAACCGGATATGAGTCCAAACCGGATA49.2Me3-Em2TGAGTCCAAACCGGAATTGAGTCCAAACCGGAAT50.7

图3 部分SSR引物在20分菊芋品种中扩增结果Fig.3 Amplification results of some SSR primers in 20 points of Jerusalem artichoke varieties

图4 部分SRAP引物在20分菊芋品种中扩增结果Fig.4 Amplification results of some SRAP primers in 20 points of Jerusalem artichoke varieties

2.2 标记的多态性分析

利用筛选出的15对特异性引物分别对20份供试材料的基因组DNA进行多态性分析(图3～4)。其中7对SSR引物在扩增结果中表现出多态性，共扩增出435个位点，具有多态性的位点234个，多态性比率为53.7 %，扩增片段为200～600 bp,其中1739、ES5717为多态性较好的引物序列；8对SRAP引物共扩增出285个位点，具有多态性位点146个，多态性比率为51.4 %。扩增片段为400～100 bp,其中Me1-Em6表现出较高的特异性。

2.3 20份菊芋品种的数字化指纹图谱的构建

利用15对引物对20份供试材料进行分子标记，根据片段大小、条带特异性选择目的条带。分析菊芋遗传多样性发现同一产地或选育机构提供的菊芋品种基因组DNA间差异较小。即青芋系列、廊坊系列以及吉菊芋和定芋系列都各自相差不太明显。20份菊芋供试材料通过2对SSR引物和4对SRAP引物(9个不同片段大小条带)可以完全被区分开。用1、0数字表示条带的有无，将扩增结果的特异性指纹图谱转化为数字，构建出菊芋数字化DNA指纹图谱(表3)，依据图谱差异可以鉴定分析来源不同的菊芋品种。借助该图谱可以快速鉴定和溯源不同地理来源的菊芋。

2.4 20份菊芋品种聚类分析

经MEGA7.0软件中UPGMA聚类方法，通过SSR和SRAP两种分析标记对20份待测品种进行亲缘关系分析(图5)，发现这些品种遗传相似系数在0.83～0.91之间。并且可以将20份品种分为六大类。第一类为Ames22746;第二类为TuB1798；第三类为TuB2050、青芋1号；第四大类包括吉菊芋3号、青芋2号、廊芋8号、TuB1799、廊坊7号、TuB1777、TuB1797、Ames22745;第五大类包括定芋1号、吉菊芋2号、青芋3号、吉菊芋4号;第六类包括USA、青芋4号、定芋2号、廊坊6号。根据分类结果发现，大多数国内品种都聚类在一起，且来源于美国的Ames22746单独分为一类。

对SSR结果单独分析发现吉菊芋2号和青芋4号的指纹图谱完全相同，它们的遗传距离为0，且根据图6a发现他们被聚类到一起。又对2种分子标记结果分析发现这2个品种仍具有一定的差异，遗传距离为0.5892。

表3 20份菊芋资源的数字化DNA指纹图谱

图5 20份菊芋品种基于SSR和SRAP分析的聚类分析图Fig.5 Cluster analysis of 20 Jerusalem artichoke variety based on SSR and SRAP analysis

3 讨 论

利用SSR、SRAP分子标记技术对12份国内菊芋品种与8份美国菊芋种质资源进行毛细管电泳，结果表明，供试材料表现出遗传多样性，中国菊芋品种与美国菊芋品种存在一定的差异性,因此菊芋品种间的遗传分化与地理差异有一定的相关性，这与邓吉良等[23]对海南地区甘薯种质资源进行SSR分子标记结果一致。其中单独对SSR结果分析发现，青芋4号与吉菊芋2号的指纹图谱完全相同，又结合SRAP结果显示这品种仍存在一定的差异，但差异不明显，推测可能是引种交流导致基因在不同地区的渗入所[24-25]。本试验扩增出的SSR、SRAP片段间遗传距离多态性较高，各位点的差异及变幅较大，说明菊芋通过长期的选择进化，其基因组保持并形成了较高的遗传变异，这可能与菊芋资源长期的无性(块茎)繁殖及存在自交不亲和性有关[24,26]。本实验所选的7对SSR特异性引物并不能完全将来自不同地区的20份菊芋品种区分出来，因此在后续实验中还需注意引物设计的特异性。

图6 20份菊芋资源基于SSR分子标记分析的聚类分析图Fig.6 Cluster analysis of 20 Jerusalem artichoke resources based SSR molecular marker analysis

目前国内外对于菊芋的遗传多样性研究的DNA分子标记方法主要是SSR、ISSR、RAPD等标记法。其中SSR标记是具有高分辨率的遗传共显性标记[27]，通过群体之间多态性比较，可有效区分基因型之间的遗传距离。此外，SSR分子标记还被广泛应用于鉴别植物品系、遗传多样性分析和系谱分析中[28]。仅对青芋系列的4个品种形态学分析，紫色纺锤状的青芋1号、浅粉色瘤状的青芋2号、白色瘤状的青芋3号以及粉色棒状的青芋4号并没有较强的相似性，但结合聚类分析得出青芋1号与青芋2号可以被划分为一大类，青芋3号和青芋4号被划分为一大类，由此可以得出相对于形态学标记，其聚类分析图能更客观地反映菊芋种质资源之间的遗传关系，这与张道微等对甘薯种质资源花青素积累的遗传多态性分析结果一致[29]。

4 结 论

本研究通过毛细管电泳，利用SSR、SRAP标记技术构建了8份菊芋品种和12份种质资源的DNA指纹图谱。通过聚类结果分析其亲缘关系发现，20份种质资源的分子标记结果基本反映了各品种间的亲缘关系。为菊芋的杂交保护工作提供了分子标记保护策略的参考依据，也可为杂优育种中亲本选配提供理论依据，并且SSR、SRAP 标记用于菊芋近似品种辅助选择是可行的。