利用ISSR和SSR标记分析不同抽薹性萝卜的遗传多样性

杨 峰，李跃建，李晓梅，雍小平，冉 科，陈 琳，覃海燕，冉茂林*

(1.四川省农业科学院水稻高粱研究所，四川 德阳 618000；2.蔬菜种质与品种创新四川省重点实验室，四川 成都 610066；3.四川省农业科学院，四川 成都 610066；4.四川省农业技术推广总站，四川 成都 610041)

【研究意义】萝卜(RaphanussativusL.)在世界各地均有种植，其中欧美国家主要栽培小型四季萝卜；亚洲国家则主要栽培大型萝卜[1]。萝卜也是我国重要的十字花科蔬菜作物，年种植面积在120万hm2左右，位居全国第三，在蔬菜生产和供应上起到了重要作用[2]。在生产上，萝卜比较容易发生“未熟抽薹”或“先期抽薹”现象，即萝卜肉质根在未完全膨大时就抽薹，从而降低或失去商品价值，造成经济损失。我国拥有众多萝卜种质资源，但开始耐抽薹品种选育的研究较晚，导致日本和韩国的耐抽薹品种大量进入国内，占据主要市场。因此，加强对耐抽薹萝卜种质资源的研究，不断培育新的种质资源，是加快耐抽薹萝卜育种进程的重要途径。【前人研究进展】自20世纪70年代开始，分子生物学研究开启了核酸时代，各类分子标记技术被广泛应用于蔬菜作物的遗传多样性研究中[3-5]。简单序列重复(Simple sequence repeat, SSR)通常又称为微卫星或者STMS(Sequence-tagged microsatellites)，是基于PCR的分子标记，普遍分布于真核生物基因组中，具有信息含量高、稳定性好、多态性高、操作和分析简单等优点，现被广泛用于蔬菜种质资源遗传多样性分析[6]及种质资源鉴定[7]等研究。近几年以萝卜为材料，利用SSR标记进行的研究，主要包括图谱构建[8-10]、基因组学[11]、转录组学[12]、表观遗传学[13]、纯度鉴定[14-15]、育性鉴定[16]和肉质根色[17]等方面。简单序列重复区间扩增多态性(Inter-simple sequence repeat, ISSR)是在SSR基础上发展起来的一种新的标记技术，其特点是快速、可靠，具有更好的稳定性和重复性，已广泛用于各类作物的遗传多样性分析[18]、品系鉴定[19]、遗传作图和基因定位[20]等研究中。随着深入研究，发现单一标记技术的支持率、分辨率均有限，难以通过单一标记，对种质分子遗传特征的本质进行体现和鉴别。因此，利用多种分子标记技术，进行遗传多样性分析，以期获得更可靠的聚类结果。而将以上2 种分子标记技术相结合，进行不同抽薹性萝卜遗传多样性分析，至今未见报道。【本研究切入点】利用ISSR及SSR分子标记，对64份不同抽薹性萝卜材料进行分析，研究其遗传多样性及亲缘关系。【拟解决的关键问题】从分子水平上研究各材料遗传背景和亲缘关系，为选育耐抽薹萝卜品种提供理论依据，以期实现分子标记辅助育种。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试64个不同抽薹性萝卜材料，均由四川省农业科学院水稻高粱研究所萝卜课题组提供。抽薹等主要特性描述参照李锡香等[21]方法，略作修改，详见表1。分子标记所需的ISSR、SSR引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，Taq酶和dNTP购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 穴盘育苗，待萝卜幼苗长至3片真叶时采嫩叶，用天根生化科技(北京)有限公司生产的高效植物基因组DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，微量分光光度计(NanoDrop 2000)检测DNA浓度和质量，将DNA浓度调至10 ng/μl，-20 ℃冰箱(海尔医用低温保存箱)保存备用。

1.2.2 ISSR扩增 ISSR引物从哥伦比亚大学(University of British Columbia Biotechnology, UBC)[22]公布的100个通用引物序列中，通过预实验筛选出16个进行多态性分析。用Applied Biosystems公司Veriti Thermal Cycler PCR仪进行扩增。ISSR-PCR反应采用15 μl体系，其中含1×PCR buffer，2.5 μmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，1UTaq酶，0.2 μmol/L引物，20 ng DNA模板。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.2.3 SSR扩增 搜索萝卜基因组数据库(http://marker.kazusa.or.jp/Daikon/及http://ioinfo.ti.cornell.edu/ cgi-bin/radish/)中公布的与抽薹开花相关的SSR引物序列信息，合成了206对，并从中筛选出21对扩增条带清晰、多态性明显较好的引物。用Applied Biosystems公司Veriti Thermal Cycler PCR仪进行扩增。SSR-PCR反应采用15 μl体系，其中含1×PCR buffer，2.5 μmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，1UTaq酶，0.2 μmol/L引物，20 ng DNA模板。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 40 s，55～62 ℃(不同SSR引物设不同退火温度)45 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.2.4 PCR产物检测 扩增产物经10 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(北京六一仪器厂DYCZ-24B型电泳仪及DYY-6D型电源)，银染检测。

1.2.5 数据统计分析 将银染结果进行统计，清晰且可重复条带记为“1”，不重复且在同一位置上的弱带或无条带记为“0”，建立数据库。统计PCR扩增产物的条带总数和多态性条带数，计算多态性条带百分率P=i/j×100 %，其中i为多态性条带数，j为扩增总条带数。用POPGENE 1.32统计观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei基因多样性指数(H)及shannon多样性信息指数(I)[23]。利用NTSYS pc-2.10e分析数据，分别求ISSR、SSR和ISSR+SSR的遗传相似系数(GS)矩阵，按非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析[24]，并用TFPGA软件进行Mantel-test[25]相关性分析。

2 结果与分析

2.1 ISSR和SSR引物多样性分析

分别对64份材料进行PCR扩增，16对ISSR引物的扩增结果见图1(部分)和表2，共扩增出90条带，每对引物扩增出2～10条带，平均4.29条，其中具有多态性的68条，多态性条带百分率为75.56 %；21对SSR引物的扩增结果见图2(部分)和表3，共扩增出86条带，每对引物扩增出2～8条带，平均4.10条，其中具有多态性的62条，多态性条带百分率为72.09 %。表明本研究中筛选到的ISSR和SSR引物多态性良好，有较显著的检出效率，可用于后续的遗传多样性分析。

图1 引物ISSR-802对64份试验材料的ISSR扩增电泳图Fig.1 ISSR-PCR amplification electrophoresis of 64 experimental materials by primer ISSR-802

图2 引物SSR-068对64份试验材料的SSR扩增电泳图Fig.2 SSR-PCR amplification electrophoresis of 64 experimental materials by primer SSR-068

表2 ISSR引物序列及扩增结果

2.2 遗传多样性分析

通过POPGENE 1.32软件分析，得到(表4)。ISSR引物对64份供试材料扩增结果中，平均观测等位基因数为2.2719，平均有效等位基因数为1.7518，有效等位基因比例为77.11 %，平均Nei基因多样性指数为0.4176，平均Shannon多态性指数为0.6045；SSR引物扩增结果中，平均观测等位基因数为1.9165，平均有效等位基因数为1.5951，有效等位基因比例为83.23 %，平均Nei基因多样性指数为0.3493，平均Shannon多态性指数为0.5232。统计分析表明，两类引物扩增结果都反映出供试材料较高的遗传多样性。

2.3 聚类分析

2.3.1 ISSR聚类分析 应用Nei等[26]的统计分析方法，计算遗传相似系数(GS)，共获得2016个两两不同材料间的遗传相似系数，变幅为0.3382～0.8676，平均遗传相似系数为0.5758，大于0.7的仅占3.22 %，其中30和34号材料间遗传相似系数最大(0.8676)，说明二者间亲缘关系最近；1和24号间的遗传相似系数最小(0.3382)，说明他们两两之间的亲缘关系最远。如图3所示，以 0.55为阈值可以把64份材料分为4大类群：第Ⅰ类包括1、2号材料，为来源于德国的极晚抽薹材料；第Ⅱ类共有57份材料，来源于中国、韩国和日本，占所有供试材料的89.06 %；第III类为13、15、16号共3份，均来源于中国的自育材料；第Ⅳ类包括3、5号材料，为来源于德国和日本的极晚抽薹材料。进一步分析可以把第Ⅱ类分为4个亚类(第2、3、4、5亚类)：第2亚类共有19份，第3亚类共有28份，第4亚类有2份，第5亚类有8份材料。

表4 4份试验材料的遗传多样性指数

图3 64份试验材料基于ISSR标记的聚类图Fig.3 UPGMA dendrograms of 64 experimental materials based on ISSR markers

2.3.2 SSR聚类分析 遗传相似系数的变幅为0.3043～0.9348，平均遗传相似系数为0.6451，大于0.7的占25.10 %，说明同样材料之间，基于SSR引物的GS要大于ISSR，所揭示的亲源关系更近。其中22和50号、41和42号材料间遗传相似系数最大(0.9348)，1和11号间的遗传相似系数最小(0.3043)。如图4所示，以 0.60为阈值把64份材料分为4大类群：第Ⅰ类包括1、3号材料，为来源于德国的极晚抽薹材料；第Ⅱ类共有59份材料，占所有供试材料的92.19 %；第III类仅有44号材料；第Ⅳ类包括5、6号材料，为来源于日本的极晚抽薹材料。进一步分析把第Ⅱ类分为4个亚类：第2、3、4、5亚类，材料数量分别为5、46、6、2份。

2.3.3 整合ISSR与SSR聚类分析 遗传相似系数，变幅为0.3772～0.8333，平均遗传相似系数为0.6038，大于0.7的仅占5.36 %，其中26和35号、30和34号材料间遗传相似系数最大(0.8333)，1和24号间的遗传相似系数最小(0.3772)。由此可知64份材料的遗传背景丰富，可作为育种资源。聚类结果如图5所示，以 0.57为阈值把供试材料分为4大类群：第I类为1、2、3号材料，包含全部来源于德国的极晚抽薹材料；第 II 类共有59份材料；第 III 类仅有来源于韩国的10号材料；第Ⅳ类仅有来源于日本的5号材料。进一步将第Ⅱ类分为4个亚类：第2亚类共有48份，占所有供试材料的75.00 %；第3亚类仅有来源于中国的20号自育材料；第4亚类有7份，其中85.71 %的为白圆萝卜材料；第5亚类有13、15、16号共3份材料。

2.4 相关性分析

对ISSR、SSR和ISSR+SSR标记的GS矩阵进行Mantel-test相关性检测。 结果表明：ISSR和SSR标记的相关性不显著(R= 0.171，P>0.05)；ISSR+ SSR与ISSR标记呈显著相关(R= 0.612，P<0.05)；ISSR+ SSR与SSR标记呈显著相关(R= 0.894，P<0.05)。

3 讨 论

遗传多样性是生物所携带的遗传信息总和，对分析重要性状和辅助育种具有重要意义。本研究中，遗传多样性结果说明，供试材料间遗传相似程度较低，不同抽薹性萝卜间遗传差异较大，遗传关系较远，这与Wang等[27]利用EST-SSR标记进行遗传多样性分析所得结果中引物多态性89.3 %，平均多态信息含量(PIC)值0.39相似。而与方平等[28]对肉质色不同萝卜遗传多样性的分析结果中，平均Na、Ne、I、GS值分别为8.7、5.1627、1.76、0.85相比较，本研究中两种分子标记的结果与其差异均较大。不同结果的产生，可能与材料来源的丰富程度，尤其是野生型材料的多少有关。由于研究目的性状的不同，所选用的分子标记差异较大，对遗传多样性结果的影响较大。

图4 64份试验材料基于SSR标记的聚类图Fig.4 UPGMA dendrograms of 64 experimental materials based on SSR markers

图5 64份试验材料基于ISSR+SSR标记的聚类图Fig.5 UPGMA dendrograms of 64 experimental materials based on SSR plus ISSR markers

在多种分子标记对种质资源遗传多样性的研究中，陈文辉等[29]利用ISSR和SRAP标记，对36个耐抽薹大白菜品种进行遗传多样性分析，2种标记都扩增出各自的多态性谱带，其结果反映出供试材料丰富的遗传多态性。对萝卜而言，Zhu等[30]和周娜等[31]，分别利用RAPD、AFLP与SRAP，以及SSR、RAPD 与RAMP各3种分子标记，对17份及32份不同萝卜材料进行种质鉴定与遗传多样性分析，表明采用不同分子标记获得的遗传距离存在差异，多种分子标记综合聚类分析，更能准确反映出萝卜材料之间的遗传关系。本研究中，ISSR与SSR标记的遗传距离间不存在显著相关，2种标记的检测水平和多态性各有不同。ISSR显示出材料间具有一定的地域差异，SSR分析的多态性可能与萝卜的重要表型性状相关。ISSR与SSR标记结合后，聚类结果既与表型性状相关，又能在一定程度上反映出材料间的地理位置关系，稍优于单独的ISSR或SSR标记。

抽薹性状为数量性状，受外界环境影响大，在十字花科蔬菜中的相关研究较多。高颖等[32]利用57个SSR和InDel标记对大白菜抽薹开花时间进行关联分析，将80份自交系及110份F1材料分为3个亚群体，发现13个标记的17个位点与抽薹时间和开花时间相关。在耐抽薹萝卜研究上，柳李旺等[33]将甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)应用于萝卜抽薹机制研究中，证明了DNA甲基化水平的变化影响萝卜抽薹开花，揭示了甲基化水平降低有利于抽薹开花相关基因的表达。刘哲等[34]对萝卜抽薹相关SRAP分子标记进行筛选与分析，获得116对多态性引物组合，多态性40.3 %，多态性条带范围为0～5，得到1个与萝卜晚抽薹基因紧密连锁的标记，遗传距离为5.7 cM。

本ISSR+SSR标记的聚类结果中，来源于德国的极耐抽薹萝卜材料分在第I大类，日本的极耐抽薹材料“时大根”在第IV大类，第II大类中则包括了极耐抽薹的“藏萝1号”和自育的C60223，而第III大类中仅有来源于韩国的“世农”。其中，日本的“时大根”与“黑萝卜”、“藏萝1号”和C60223间的GS值分别为0.4737、0.5175和0.5351，遗传差异大，可作为耐抽薹杂交亲本材料加以利用。同时，本研究的聚类结果可将大部分地理来源相近的材料聚为一类，但与抽薹性状之间仍存在差别。这可能是由于分子标记体现的是种质材料间分子水平上的差异，而表型性状差异是环境与基因互作的结果。

4 结 论

不同抽薹性萝卜材料所表现出的丰富多样性，对萝卜种质资源管理和耐抽薹品种选育具有重要意义。本研究采用多种分子标记相结合的方式，获得更可靠的聚类结果，能在一定程度上反映出不同抽薹性萝卜材料间亲缘关系，后续选择遗传相似度低、亲缘关系远的材料作为亲本，应用于育种，以提高后代遗传重组率，增强杂种优势。