饲料中没食子酸含量的测定高效液相色谱法

◆作者：郝燕娟 陈焱 洪英达 黄佳吟 刘丽英

◆单位：广州汇标检测技术中心

没食子酸具有抗菌抗病毒的作用，但应用在饲料、食品方面上比较少，随着工艺的的发展，有些企业研究将没食子酸应用在饲料上，但目前尚无手段对此类产品进行检测。本文利用加热超声对饲料样品进行提取，建立了液相色谱法检测饲料中没食子酸的分析方法，可为加强日常监控和质量控制提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

高效液相色谱仪（配紫外检测器），万分之一分析天平，超声波清洗仪。

1.1.2 试剂与药品

纯水（符合GB/T 6682一级水的要求）、甲醇（色谱纯）、磷酸（优级纯）、没食子酸对照品（Dr.Ehrenstorfer，CAS 号 149-91-7），纯度≥95%。没食子酸的化学结构式如图1所示。

图1 没食子酸的化学结构式

1.1.3 试验材料

试验使用的饲料均为添加没食子酸的混合料。按GB/T 14699.1的规定抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。然后按照GB/T 20195的规定制备样品，粉碎过后过0.45 mm孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中，备用。

1.2 标准溶液及试剂配置

1.2.1 标准储备液的配置

准确称取没食子酸标准品50mg（精确至 0.1mg），加水溶解并定容至50mL棕色容量瓶，此为标准储备液，4℃保存，保存期为一个月。

1.2.2 混合标准中间工作液的配置

取没食子酸标准储备液用水逐级稀释成约为 1μg/mL、5μg/mL、 10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL系列标准工作液。

1.3 样品前处理

准确称量试样1 g（精确至0.0001 g）于150 mL磨口锥形瓶中，加入水50.0 mL，于超声波清洗仪中70℃加热提取30min，期间摇动2次，取出冷却，过滤，弃去上清液，过0.45μm滤膜，供高效液相色谱仪测定。

1.4 色谱条件

1.4.1 色谱柱

Hypersil GOLD aQ（4.6*150 mm,5μm）或相当者。

1.4.2 色谱条件

流动相：甲醇：0.05%磷酸（5+95）

流速：1.0mL/min

柱温：30℃

进样量：20μL

图2 对照品溶液10μg/mL

2 结果

2.1 系统适应性试验

分别取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，在271nm处的色谱图见图2与图3，按1.4色谱条件下，没食子酸的理论塔板数分别为17956、17650，供试品溶液中的分离度大于1.5，没食子酸得到很好的分离。

2.2 线性关系

配制浓度约为 1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL的标准工作液，经0.45μm微孔滤膜过滤后供液相色谱仪测定。以没食子酸色谱峰面积为横坐标，标准工作液浓度为纵坐标，绘制标准曲线，所得线性方程为Y=0.7214x+0.3835。结果显示，没食子酸在1.2066～60.3300μg/mL 范围内的线性良好，相关系数（R2）为0.9991。

图3 供试品溶液

表1 回收率试验结果

2.3 精密度试验

本文以浓度为12.0660μg/mL的标准工作溶液对仪器进行精密度的测试，按1.4色谱条件连续进样6次，没食子酸的保留时间和峰面积基本稳定，保留时间的相对标准偏差（RSD）为0.11%，峰面积的相对标准偏差为0.34%，结果表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

取同一批供试品（2018090949），分别在样品处理后的 0、1、2、3、4、5、6h 进样，测定其峰面积相对标准偏差为0.37%，表明溶液在6h内稳定。

2.5 重复性试验

取饲料样品（2018090949）6份，按1.3项下的方法制备供试品溶液，按1.4分别进样测定含量。结果样品中没食子酸含量的相对标准偏差为1.88%，说明方法重复性良好。

2.6 加标回收率试验

取2.5项下已测含量的饲料样品（2018090949）6份，分别称取 0.5g，精密称定，置于150mL三解瓶中，分别加入1206.6μg/mL没食子酸对照品储备溶液300μL，按1.3项下的方法制备供试品溶液，按1.4分别进样测定含量。回收率结果见表1。

3 讨论与小结

采用DAD检测器在200～400nm进行扫描，在215和271nm波长处有最大吸收，由于215nm波长较短，可能产生干扰，故选用271nm作为检测波长。对流动相的选择，加入磷酸有助于改善峰型减少拖尾，选用甲醇-0.05%磷酸（5+95）作为流动相，没食子酸与其他组分色谱峰可以得到较好的分离。分别选择超声、加热回流、浸泡的方法考察，结果表明超声效果较好而且操作方便，故采用超声方法。再对超声 45min与 70℃超声30min进行考察，结果发现70℃加热超声提取充分，故选择70℃加热超声30min。

结果表明，在该液相色谱条件下，没食子酸峰与相邻的组分峰的分离度好，该方法的精密度、重复性、稳定性、回收率试验均符合规定。该方法操作简便、快速、可作为制定饲料中没食子酸检测标准的参考依据。