灰霉病菌对嘧霉胺的抗性诱导研究

2019-09-27余正军范晓培

农家科技下旬刊 2019年7期

余正军范晓培

摘要：为了获得蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗性突变体，在室内通过对亲本敏感菌株进行药剂驯化和紫外线的联合诱导，获得了抗嘧霉胺突变体。结果表明：在自然条件下很可能产生高抗性的抗嘧霉胺突变体。

关键词：灰霉病菌;嘧霉胺;药剂驯化;紫外线诱导;抗性突变体

近年来，由于长期单一使用同一种农药，病虫害的抗药性也随之增强;因此我国的科技工作者对农作物的病害防治方面做了大量的研究。在我国引进嘧霉胺防治灰霉病害后，在一段时间内极大地提高了农作物的产量，病虫害也降低到了一個较低的水平。但过了3-4年后，在浙江、江苏和湖南等地就出现了关于灰霉病菌对嘧霉胺产生了抗药性的报道。因此本研究在前期研究结果基础之上，在室内对灰霉病菌进行了抗性诱导，了解蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗性水平，以便采取相应的治理对策，延缓嘧霉胺的施用年限。

一、材料与方法

1.试验材料

（1）材料。供试菌株TG30和YX45由山西农业大学农药学研究人员从蔬菜保护地上分离得到。

供试杀菌剂：96.1%嘧霉胺原药，由山东双星农药厂提供。

PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL

含药培养基：96.1%嘧霉胺原药用丙酮配成10?g/mL的母液，然后把母液放在4℃的冰箱中贮藏。使用时以无菌水进行稀释，以10%药液量加入融化的PDA培养基中（冷却至45℃～50℃）充分摇匀，制成含最终所需药量的PDA平板，

（2）仪器。主要仪器：HD-29型净化操作台（哈尔滨东联电子技术开发有限公司），SPX型智能生化培养箱（宁波江南仪器厂），DHG-9140型电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），高压蒸汽灭菌锅（上海审安医疗器械厂），A205型万分之一电子天平（德国），微波炉（青岛海尔集团）。

2.试验方法

（1）紫外线诱导。将与相对敏感基线相接近的TG30和YX45作为供试菌株，将其在PDA平板上培养4d后，加入8-10mL无菌水，用接种环轻轻刮下孢子，制成悬浮液于到入三角瓶中，用无菌水稀释，在10×10倍显微镜下检查孢子浓度，以每视野50-60个孢子为宜。用移液枪吸取孢子悬浮液200?L注入PDA平板中，用涂布器均匀涂抹，使孢子分散开，打开盖放在超净工作台内，紫外灯下20cm处进行照射，每照射20min后就从菌落边缘取3块菌块，将菌块转接到新的含药培养基上，用牛皮纸包好迅速放于25℃黑暗条件下培养，直至能再含药平板上生长、形成扇形的突变体。

（2）药剂驯化。将供试菌株TG30和YX45在PDA平板上培养3d后，取生长边缘菌块移入含嘧霉胺1μg/mL的PDA平板上，25℃下连续继代培养进行药剂驯化，10d作为1代。自每代的菌落边缘取菌丝块接入含药平板上培养，采取相同方法逐步提高药剂浓度直至获得能在含500μg/mL嘧霉胺平板上生长的抗性抗性突变菌株，则表明菌株这一继代培养物已对嘧霉胺产生抗药性，即得到了抗药性菌株。

（3）紫外线诱导和药剂驯化。紫外线诱变参照Bruin等介绍的方法：将嘧霉胺亲本敏感菌株TG30和YX45接种于PDA平板上，25℃培养4d后，用打孔器在菌落边缘打取直径为4mm的菌块，洗下孢子制成孢子悬浮液（浓度为8×105个/mL），然后涂在含嘧霉胺亚致死剂量1?g/mL PDA平板上，每平板0.1mL，培养24h后，置于紫外灯（15w，254nm）下照射20min，照射距离为20cm。然后在25℃下黑暗培养10d将幸存菌落转接到含最低抑制剂量嘧霉胺的培养基上，用相同的方法逐步提高药剂浓度培养，直到获得抗性突变菌株。半个月后得到在500μg/mL药剂浓度的培养基上紫外照射20min仍可生长菌株TG30-1、TG30-2、TG30-3、TG30-4、TG30-5、TG30-6、TG30-7、TG30-8。

二、结果与分析

1.紫外诱导

选取灰霉菌株TG30和YX45作为供试菌株，在室内经过紫外线照射后，形成一个扇形的突变区域。由表1可以看出，随着紫外诱导的时间的不同，灰霉菌株的突变程度也是不同的;紫外线照射的时间在20-40min之间时，TG30的突变频率是最高的，而随着照射时间的延长，其突变频率呈直线下降的趋势。而YX45在通过照射紫外线照射后，几乎没有产生突变体，所以就选取TG30作为供试菌株，而蔬菜灰霉菌株TG30在室内产生抗嘧霉胺的突变体的最适宜的时间为20-40min。

2.药剂驯化

选取灰霉菌株TG30和YX45作为供试菌株，在含嘧霉胺的PDA培养基上进行培养，培养10代后，灰霉菌株由原来的最低抑制浓度1μg/mL提高到500μg/mL的浓度，则证明对灰霉菌株的药剂驯化成功。具体过程由图1：

3.紫外诱导和药剂驯化

由图2可以看出，蔬菜灰霉菌株TG30的孢子在萌发的时候，经过紫外线诱变7次后，由起初的嘧霉胺最低抑制剂量1μg/mL，提高到在含500μg/mL嘧霉胺的平板上可继续扩展，则说明蔬菜灰霉病菌的敏感菌株在紫外线诱变和药剂驯化双重诱导条件下可突变为对嘧霉胺的抗性菌株。证明抗性诱导成功。

三、小结与讨论

任何一种新农药在被投放到市场之前，都要对其抗药性的风险进行评估，为蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗性风险，本实验采用在室内对蔬菜灰霉病菌进行药剂驯化、紫外线诱导或者两者结合起来进行联合诱导。

为了获得蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗性突变体，本实验在室内通过对亲本敏感菌株TG30进行药剂驯化和紫外线的联合诱导，获得了抗嘧霉胺突变体;而药剂驯化或紫外线对敏感菌株TG30单独诱导出的抗嘧霉胺突变体的抗性倍数并不等于联合诱导出的抗嘧霉胺突变体的抗性倍数，由此可以推断，药剂自然条件下能否得到合理使用，这对于蔬菜灰霉病菌抗药性的产生起着非常重要的作用，如果长时间使用一种药剂防治灰霉病害，就很容易使灰霉病菌对药剂产生抗药性，从而导致灰霉病菌对药剂的敏感程度降低，最终很可能失去其应有的防治效果。因此，在实际生产中，应该合理使用农药，在药剂对病原菌产生抗药性后，应改变防治方法，制定合理的防治对策，从而延长药剂的使用年限，避免病害的大面积发生。

参考文献：

[1]叶钟音，周明国，刘经芬等. 植物病原菌对杀菌剂抗性的概况[J]. 南京农业大学学报， 1987， 10 （4）：154-165.

[2]李红霞，叶钟音，周明国等. 植物病原菌对苯并咪唑类及相关杀菌剂的抗药性[J]. 植物保护， 1987，13 （2）： 31-33.

[3]Van Tuyl J M. Genetics of fungicide resistance. Mededelingen. Land bouwhoge school， Wageningen： 1977， 77 （2）： 236.

[4]韩贻仁主编. 分子细胞生物学（第二版）. 北京科学出版社， 2002.

[5]方中达.植病研究法[M].中国农业出版社.1998.124.

[6]Borck M K. Studies on the mode of action of benomyl in Xeurospo.ra crassa. Ph.D Thesis， Lousiana State University， 1973， 171.

[7]董金皋等，农业植物病理学（北方本）[M].北京，中国农业出版社，2001，183-185.

[8]胡伟群，陈杰.灰霉病的化学防治进展[J].现代农药，2002（4）：8-11.

[9]黄启良，李风敏，王敏.40%嘧霉胺悬浮剂防治黄瓜灰霉病药效试验.植物保护，2000，26（2）：44-45.

[10]杨套涛，关天舒.保护地番茄灰霉病抗药性治理策略的理论模型和实践[J].辽宁农业科学，2002，（2）46-47.

[11]余正军，刘慧平.山西省蔬菜灰霉病菌对嘧霉胺的抗性监测[J].山西农业大学学报（自然科学版），2012，32（1）.