上调Uqcrc1表达在过氧化氢诱导的心肌细胞氧化应激中的作用

梁 霄，柏小川

遵义市第一人民医院心血管内科贵州遵义563000

心血管系统疾病是一类危害人类生命健康的常见疾病，其中心肌细胞损伤是心血管系统疾病发生的重要原因;缺氧复氧、酸中毒等都可诱导心肌细胞发生氧化应激，细胞内过量的氧自由基可以诱导细胞发生凋亡［1］。泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白1(ubiquinol-cytochrome C reductase core protein 1，Uqcrc1)定位于线粒体内膜，是一种与线粒体呼吸链有关的蛋白亚基，参与细胞生长、氧化应激等过程［2］。有研究［3］表明，在心肌细胞中 Uqcrc1 具有抗缺氧复氧损伤和抗凋亡的作用;而在肿瘤细胞中的研究［4］却显示Uqcrc1具有抑制细胞生长、促细胞凋亡的作用。本研究用过氧化氢(H2O2)处理心肌细胞，体外构建心肌细胞氧化损伤模型，通过感染Uqcrc1慢病毒上调心肌细胞中Uqcrc1的表达水平，探讨Uqcrc1在心肌细胞氧化损伤中的作用。

1 材料与方法

1．1 主要材料 心肌H9c2细胞购自南京科佰生物科技有限公司，在体积分数10%胎牛血清和体积分数90%DMEM的细胞培养液在饱和湿度、37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗体、过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所;PCR试剂购自大连TaKaRa公司;Uqcrc1过表达慢病毒和阴性对照慢病毒均由上海吉凯基因化学技术有限公司构建;Uqcrc1抗体购自上海樊克生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性检测试剂盒和丙二醛(MDA)含量检测试剂盒均购自南京建成生物研究所;活化型Caspase-9(Cleaved Caspase-9)抗体购自美国 Abbkine公司;乳酸脱氢酶(LDH)含量检测试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司。

1．2 慢病毒感染及实验分组 将H9c2细胞接种到12孔板内，细胞密度达40% ～50%时，分别在细胞中添加Uqcrc1过表达慢病毒和阴性对照慢病毒液(MOI=20)，继续培养12 h以后，取出培养板，吸弃上清液，添加新鲜的细胞培养液，继续培养3 d以后，在荧光显微镜下观察，感染效率均高于90%。病毒感染后细胞分别在200μmol/L的H2O2细胞培养液中培养12 h(Lv-NC+H2O2组、Lv-Uqcrc1+H2O2组)。以只用200μmol/L H2O2细胞培养液处理的细胞为模型对照(H2O2组)。以不感染慢病毒和不用H2O2培养的H9c2细胞为空白对照(H9c2组)。

1．3 细胞中Uqcrc1 m RNA及蛋白表达的检测

①qRT-PCR:用Trizol试剂分别提取细胞中的总RNA，RNA样品A(260 nm)/A(280 nm)的比值大于1．8且小于2．0。按试剂盒说明书进行反转录，cDNA保存在－20℃。以cDNA作为模板进行PCR，反应体系:2．0 μL的 cDNA 模板，0．4 μL的引物，10．0 μL 的 PCR Master Mix，7．2 μL 双篜水。PCR反应条件:预变性95℃ 5min，变性95℃ 15 s，退火 60℃ 1 min，共40个循环。按照2－ΔΔCt法计算Uqcrc1表达水平。Uqcrc1上游引物序列 5’-CGGGGCAAAAACATCCTTAG-3’，下游引物序列5’-GCGGCGGCCATAAGTCAG-3’。内参β-actin上游引物序列 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物序列5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。实验重复3次。

②Western blot:在细胞中加入含有PMSF的RIPA 裂解液［V(RIPA)∶V(PMSF)=100∶1］，于冰上裂解、12 000×g离心后，BCA法测定蛋白浓度。分别在蛋白样品中添加1/4体积的5×上样缓冲液，100℃变性5 min，按照每个孔内加入40μg蛋白样品进行上样，凝胶为100 g/L的下层胶和50 g/L的上层胶，设置上、下层胶电泳电压分别为70、120 V，电泳时长共2．5 h。按照半干法于冰上进行转膜，转膜电流为180 mA，转膜时间为50 min。电转后的NC膜用牛血清白蛋白室温封闭约1．5 h，再依次用一抗(按1∶800稀释)、二抗(按1∶4 000稀释)反应后，ECL法发光，Odyssey扫描后，以β-actin作为参照，分析Uqcrc1蛋白水平。实验重复3次。

1．4 各组细胞增殖的CCK-8法检测 将4组细胞接种到96孔板内，每孔添加100μL细胞培养液，继续培养12 h，吸弃孔内液体，每孔添加90μL细胞培养液和10μL CCK-8工作液，孵育4 h以后，检测450 nm的A值。设H9c2组细胞存活率为100%，分析其他3组细胞存活率(与H9c2组存活率的比值)的变化。实验重复3次。

1．5 各组细胞中LDH漏出率的二硝基苯肼显色法检测 分别检测4组细胞培养液和细胞中LDH水平，LDH检测方法用二硝基苯肼显色法，具体操作步骤参照试剂盒说明书，以培养液中LDH水平占总LDH水平(培养液和细胞中LDH水平之和)的百分比表示LDH漏出率。实验重复3次。

1．6 各组细胞中 SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量检测 分别检测4组细胞中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量，步骤均同试剂盒说明书，SOD检测用黄嘌呤氧化法，CAT检测用钼酸铵比色法，GSH-Px检测用ELISA法，MDA检测用硫代巴比妥酸法。实验重复3次。

1．7 各组细胞凋亡率的双染法检测 用D-Hanks液将各组细胞洗涤以后，调整细胞密度为1×106个/mL，吸取1 mL细胞悬液，用500μL的Binding Buffer重悬后，添加Annexin V-FITC 5μL，放在避光条件下孵育20 min后，再添加5μL的PI，4℃孵育5 min，上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1．8 各组细胞中 Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平检测 用Western blot法检测4组细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达水平，步骤同前，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9一抗均按1∶600稀释。实验重复3次。

1．9 统计学处理 采用SPSS 21．0进行数据分析，应用单因素方差分析和SNK-q检验比较各组细胞中Uqcrc1 mRNA和蛋白表达水平，细胞存活率和LDH漏出率，SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量，细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达的差异，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 上调Uqcrc1表达对H2O2条件下H9c2细胞中Uqcrc1表达的影响 结果见表1。由表1可知，Lv-Uqcrc1+H2O2组细胞中Uqcrc1 mRNA和蛋白表达水平均明显高于H2O2组和Lv-NC+H2O2组。

2．2 上调Uqcrc1表达对H2O2诱导的H9c2细胞损伤的影响 结果见表 2。由表 2可知，上调Uqcrc1的表达可抑制H2O2诱导的H9c2细胞损伤。

2．3 上调Uqcrc1表达对H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激的影响 结果见表3。由表3可知，上调Uqcrc1的表达可抑制H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激。

2．4 上调Uqcrc1表达对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡的影响 结果见表 4。由表 4可知，上调Uqcrc1的表达可抑制H2O2诱导的H9c2细胞凋亡。

表1 各组H9c2细胞中Uqcrc1 mRNA和蛋白表达水平比较(n=3)

表2 各组H9c2细胞存活率和LDH漏出率比较(n=3)

表3 各组H9c2细胞中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量(n=3)

表4 各组H9c2细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达水平(n=3)

3 讨论

心血管系统疾病是影响人类寿命和生活质量的常见疾病，其发病机制较为复杂，肾素-血管紧张素活性升高、交感神经激活、血管内皮组织损伤、心肌损伤等［5-7］均与其发生有关。氧化应激是心血管系统疾病发生的重要原因，氧化应激能够促进心肌细胞中LDH释放至细胞外，检测细胞LDH漏出率可以间接反映细胞损伤程度［8-9］。本实验结果显示，H2O2处理后的心肌细胞LDH漏出率升高，细胞存活率降低，提示成功构建了心肌细胞氧化损伤模型。

Uqcrc1是线粒体呼吸链复合体Ⅲ上的功能亚单位，其表达变化可以直接调控线粒体功能，Uqcrc1表达下调能够诱导线粒体呼吸障碍［10-11］。有研究［12］显示，心肌损伤与线粒体损伤有关，Uqcrc1具有保护缺氧复氧心肌细胞损伤的作用，过表达Uqcrc1能够减少心肌细胞凋亡，提高心肌细胞活性。本实验结果显示，过表达Uqcrc1后的心肌细胞经H2O2处理以后，细胞存活率升高，LDH漏出率降低，提示Uqcrc1在心肌细胞损伤中发挥保护作用，可能是心肌保护的新靶点。

生理状态下适量的氧自由基对于维持机体内氧化平衡状态及信号转导具有重要意义，当机体内的氧自由基数量远远高于抗氧化系统的清除能力时，氧自由基过量积累，导致细胞内脂质发生过氧化，产生大量的 MDA［13-15］。SOD、CAT、GSH-Px 是抗氧化酶，其活性降低可以直接导致细胞内氧自由基积累［16］。另外，过量的氧自由基可以激活细胞内Caspase凋亡反应，诱导细胞凋亡［17］。Caspase是广泛存在于人类组织中的凋亡相关蛋白，其含有多个蛋白成员，分别在细胞凋亡过程中发挥不同的作用，Caspase-9和Caspase-3分别位于Caspase凋亡反应的上游和下游，正常状态下以没有活性的酶原形式存在，只有被激活后才可以诱导细胞凋亡发生［18-20］。本研究结果显示，Uqcrc1可以提高 H2O2条件下心肌细胞中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性，减少细胞中MDA的产生，降低细胞凋亡率，减少细胞中活化的Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平，提示Uqcrc1可能通过提高心肌细胞抗氧化能力，减少氧化应激诱导的细胞凋亡的发生。

综上所述，Uqcrc1在氧化应激条件下的心肌细胞损伤中发挥保护作用，上调Uqcrc1能够减轻心肌细胞凋亡和氧化损伤，这对于研究Uqcrc1在心血管系统疾病中的作用具有重要意义，本研究为Uqcrc1治疗心肌损伤提供了参考。作者将在以后的实验中进一步研究Uqcrc1在缺氧复氧、高糖等引起的心肌细胞损伤中的作用。