肉鸭浆膜炎的诊断和治疗

周德刚，左春生

(1.洛阳惠中兽药有限公司，河南 洛阳 471000；2. 信阳农林学院 牧医工程学院，河南 信阳 464001)

鸭传染性浆膜炎(infectious serositis of duck)又称鸭疫里氏杆菌病，由鸭疫里氏杆菌(R.anatipestifer)引起的鸭、鹅、火鸡等禽类的急性或慢性败血性传染病，在世界范围内广泛存在，目前已成为严重危害养鸭业生产的主要疾病，该病以纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为主要病变特征，病死率高达90%，给养鸭业造成了巨大的经济损失[1-4]。该病菌通常存在于患病动物的全身各组织、分泌物和排泄物中，不良因素刺激、抵抗力下降、病菌侵入机体等引起发病，天气气候突变极易暴发，给养殖场造成很大的经济损失。信阳地区水网密布，适合鸭的养殖，鸭的养殖量位居河南省首位，但鸭浆膜炎较常发生，给养殖户带来较大经济损失。为更好地防治该病，作者将收集到的病死鸭样品进行细菌分离、鉴定与药敏试验，以期为浆膜炎的防控提供参考。

1 发病情况、病料收集

1.1 发病情况

信阳市某肉鸭场，存栏3000只25日龄麻鸭。2019年3月18日发病，病鸭出现精神萎顿、厌食少食、腹泻排绿色粪便、运动失调、角弓反张等症状，到3月23日已经死亡200多只。

1.2 样品采集

取病死鸭全血、肺脏、肝脏、脾脏等部位，2～8℃冷藏被检；用无菌棉签取病死鸭口腔、泄殖腔双拭子样品，放装有PBS的离心管中，冷冻保存备检。

2 检测方法

2.1 病料剖检

将病死鸭仰卧于解剖台上，从胸骨后缘两侧沿肋骨中部剪开，暴露腹腔；再小心剪开头部皮肤，露出脑膜，观察并记录其病理变化。

2.2 细菌分离、镜检

用无菌刀剪取新鲜死鸭病变明显部位，划线接种于麦康凯琼脂平板、巧克力平板上，在37℃温箱中培养24h以上，观察菌落生长情况，并取生长菌落纯培养；取病死鸭组织器官、平板上培养物涂片，革兰氏染色后，显微镜下观察细菌形态。

2.3 生化鉴定

将纯培养物接种于含有5%胎牛血清的LB液体培养基中，随后取少量培养液加入生化鉴定管中，在温箱中37℃培养24h后，观察并记录结果。

2.4 PCR鉴定及测序

用禽流感通用型PCR检测试剂盒检测双拭子样品，检测鸭群是否有禽流感病毒感染。

采用DNA提取试剂盒提取采集组织及分离培养菌的DNA，参照文献[5]建立的鸭疫里氏杆菌PCR检测方法操作：设计针对鸭疫里氏杆菌的16SrRNA 特异性引物序列，上游引F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATG；下游引物 R：TACGGCTACCTTGTTACGACTTAGC，预计扩增目的1481 bp；反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 40 s，52 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。

对采集的样品及培养物进行PCR扩增，电泳检测，提取阳性质粒送生物公司测序，并将测序结果同已发表的序列进行同源性比较。

2.5 分离菌株的药敏试验

采用纸片法[6-7]测定强力霉素、头孢曲松、新霉素、阿米卡星、阿莫西林、大观霉素、恩诺沙星、林可霉素、氨苄西林、氟苯尼考等10种药物对分离细菌的敏感性，通过测定抑菌圈的直径(Φ)判定药物对鸭疫里氏杆菌的敏感性。

2.6 检测用仪器及试剂

所用仪器：光学显微镜(上海无陌光学仪器有限公司)；台式高速冷冻离心机(湖南湘仪)；荧光PCR仪、核酸提取仪(杭州朗基科学仪器有限公司 )；PCR仪(美国伯乐公司)；电泳仪、凝胶成像系统(北京六一生物科技有限公司)；数显恒温水浴锅；生化培养箱。

主要检测试剂：禽流感病毒通用型单重荧光PCR检测试剂盒(批号：20180906)，购自北京亿森宝生物技术有限公司；普通Tap DNA聚合酶、10×缓冲液、dNTP、DNA Marker、琼脂糖等购自大连宝生物工程有限公司；DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；LB培养基、麦康凯平板、巧克力琼脂平板、胎牛血清、革兰氏染色试剂、细菌生化鉴定管、药敏片(部分自制)等购自郑州宝赛科贸有限公司。

3 检测结果

3.1 观察症状及病理变化情况

从图1、图2看到，病鸭角弓反张，倦怠、缩颈、眼鼻有分泌物，排淡绿色粪便；解剖后看到全身浆膜面有纤维性渗出物，典型纤维性心包炎、肝周炎(见图3)。

图1病鸭角弓反张 图2拉绿色稀粪

图3病死鸭肝脏、心脏上包一层纤维素膜 图4鸭疫里氏杆菌染色图片

3.2 细菌分离及镜检结果

分离菌在麦康凯平板上不生长，在巧克力琼脂平板培养后，形成直径1～2mm菌落，菌落表面光滑、圆形、半透明状，未出现溶血现象；将分离物和培养菌落直接涂片，革兰氏染色后，显微镜下观察，可见两端钝圆的短杆状的球杆菌，革兰氏阴性(见图4)，结合生化鉴定试验结果初步判定为鸭疫里氏杆菌。

3.3 分离菌生化鉴定结果

从表1 可以看出，本试验分离的菌株氧化酶和触酶阳性，不发酵葡萄糖、蔗糖，吲哚试验、VP和甲基红试验、脲酶阴性，不产生硫化氢。

表1 分离菌株生化鉴定结果

3.4 分离菌株的PCR鉴定结果

病料提取DNA后，禽流感病毒荧光PCR扩增为阴性，该鸭群无禽流感病毒感染(见图5)。将分离菌进行普通PCR扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳，在1400bp左右处出现明显条带(见图6)，与期望目的片段一致，将测序结果与已发表的鸭疫里氏杆菌基因序列对比，同源性达99.2%以上，确定本试验分离菌为鸭疫里氏杆菌。

图5样品禽流感病毒扩增结果
M：DNAMarker(DL2000)；1：样品，P：阳性对照，N：阴性对照图6病料PCR扩增图

3.5 药敏筛选结果

对分离细菌株药敏试验结果见表2，大部分药物对此次试验分离株是高敏的，阿莫西林、林可霉素中敏，只有氨苄西林耐药。

表2 巴氏杆菌药敏试验情况

注：抑菌圈直径大于15mm者为高敏药物；直径为10～15mm者为中敏药物；直径10mm以下者为耐药。

4 分析与讨论

鸭浆膜炎是引起肉鸭死亡的主要疾病之一，主要危害2月龄以内的雏鸭，但以2～3周龄最易感，严重者发病率90%以上，死亡率5%～75%不等，给鸭养殖户带来较大经济损失。对鸭群来说，在气温骤变或有应激因素存在时，较易发生传染性疾病，而且以传染性强、发病率高为特征，多为混合感染，死亡率较高，给诊断和治疗带来难度。本研究采用细菌培养、镜检、生化及PCR鉴定等手段在信阳地区发病鸭群中分离到鸭疫里氏杆菌；为防治该病，又采用药敏试验筛选出氟苯尼考、头孢曲松等高敏药物，为防治该病提供指导。该养殖户采用清瘟败毒散配合氟苯尼考拌料治疗3天后，未再出现鸭浆膜炎病例，全群病情得到控制。

鸭浆膜炎是常见、多发的禽类传染病，病原菌可经患病动物的排泄物、分泌物等污染的饲料、饮水、用具和内外环境传播，也可经消化道传给健康动物，飞沫、咳嗽排出的带病菌也可传播本病。为防控该病，建议鸭场采取综合性防控措施：一是给予鸭群特异性抵抗力，选择针对本场流行毒株的鸭浆膜炎疫苗在7日龄、21日龄免疫鸭群；二是加强饲养管理，改善鸭群生长环境，给予营养合理的饲料，定期在饲料中添加保健性药物和抗应激药物，提高抵抗力；三是要做好鸭舍的清洁卫生，定期清粪、消毒鸭舍，减少各种细菌传播因素；四是为了降低药物的耐药性，可以采用细菌分离和药敏试验筛选防治药物。