息半夏脱毒技术研究及应用

肖颖，商天奕

(信阳农林学院 生物与制药工程学院，河南 信阳 464000)

半夏 Pinellia temata ( Thunb.) Breit 为天南星科多年生草本植物，具有润燥化痰、降逆止呕、消肿散结之功效[1]。现代医学研究表明，半夏有抗肿瘤、降血脂和保肝等[2]许多重要的功能。半夏的人工栽培日益扩大，但人工栽培的品种(品系)极易受到病毒的侵染，如紫花苜蓿花叶病毒、马铃薯病毒、大豆花叶病毒、黄瓜花叶病毒和魔芋花叶病毒等广泛存在于半夏植物中，病毒不断积累，不仅使病害更为严重，还可传给后代。当前，对半夏组织培养的研究主要集中在半夏的愈伤组织诱导上[3-5]，对半夏的解毒技术研究较少，至今没有有效杀灭半夏植株细胞内病毒的方法。因此，幼苗移栽前的预防就显得尤为重要。本文将已经受侵染的半夏幼苗进行多种脱毒处理，获得大量无病毒优质种苗以恢复半夏种性，提高产量[6]。

1 材料

半夏取自河南省息县药材种植地。清洗半夏叶后，将其浸泡在0.1% HgCl2溶液中约10 min，用无菌水冲洗几次，并在无菌条件下切成约1 cm的小块。消毒后接种到MS+ 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1mg/L培养基上，加入蔗糖、琼脂，pH值调至5.5～6.5，光照强度调至2000～3000Lx，光照时间10～12 h/d，培养温度25～27℃左右。大约20 d，可以看到叶子变厚，在叶缘切口处发现新鲜的绿色愈伤组织；大约50d，愈伤组织分化成芽并形成完整的再生植物。

1.1 茎尖大小选择

选择再生植株生长良好的块茎以获得幼芽，并通过用0.1% HgCl2溶液浸泡10 min对表面进行消毒。剥离茎尖的长度分别为0.2～0.3 mm、0.3～0.4 mm、0.4～0.5 mm、0.5～0.6 mm、0.6～0.7mm、0.7～0.8 mm，每个处理6瓶，将五个茎尖接种于组培瓶，培养基为MS+6-BA1.0mg/L+ NAA0.1mg/L，观察50d。

1.2 温度处理选择

选取生长良好的组培苗，分别在20、25、30、35、40、45℃进行高温脱毒处理，每次处理6瓶，并将5个组织培养幼苗接种到组织培养瓶中。培养基为 MS+6-BA1.0 mg/L+ NAA0.1 mg/L，观察30 d。

1.3 化学物质处理选择

选取生长良好的组培苗，在培养基中分别加入三氮唑核苷、碱性孔雀绿、阿糖腺苷、2-硫尿嘧啶、放线菌素 D、病毒唑，对于6瓶的每次处理，将5个组织培养幼苗接种到组织培养瓶中，培养基为 MS+6-BA1.0 mg/L+ NAA0.1 mg/L.观察30 d。

2 方法与结果

2.1 息半夏茎尖大小对成活率和脱毒效果的影响

将在显微镜下剥离的茎尖接种在愈伤组织诱导培养基上进行培养，剥落时小心不要损坏阀杆尖端。从表1可以看出，茎尖在0.2～0.3 mm，存活率不到一半，但组织培养幼苗生长良好，叶片均无斑点，病毒脱除率可达100.0%；茎尖在0.5～0.8 mm的存活率很高，高达80.0%。0.7～0.8 mm茎尖成活率甚至高达90%以上，但叶片大面积出现斑点。考虑到茎尖成活率与各病毒去除率的关联，最好选择0.4～0.7 mm的茎尖进行脱毒繁育。

表1 茎尖大小对息半夏组培苗成活率和脱毒效果的影响

2.2 高温处理对息半夏成活率和脱毒效果的影响

将栽培的半夏组织培养幼苗置于MS+6-BA1.0 mg/L + NAA0.1 mg/L培养基中。 温度调至30～35℃进行预处理，在不同时间去除经高温处理的幼苗，并在解剖显微镜下用带有1～2个0.2～0.5 mm的叶原基切割茎尖。诱导成苗，以叶片不带斑点为脱毒成功。结果见表2。

在一定范围内，随着半夏茎尖处理温度增加，茎尖脱毒效果显著。然而处理温度超过一定范围后，植株的成活率又出现下降。高温处理25℃以上时，脱毒率可明显提高。处理超过35℃以上，植株出现大范围死亡(表2)。因此半夏高温处理的最佳温度宜为25～35℃左右。

表2 高温处理对息半夏组培苗成活率和脱毒效果的影响

2.3 化学物质对息半夏试管苗侵染病毒的控制效果

向培养基中加入不同的化学物质，将无菌幼苗传代培养并转移以观察其生长情况。从表3可以看出，表中各种化学物质对几种被污染的病毒都具有一定的抑制作用，其中以三氮唑核苷效果最好。从生长情况看,碱性孔雀绿会造成生长受到抑制；阿糖腺苷易造成玻璃化。综合考虑抑菌效果和对生长的影响,以三氮唑核苷或放线菌素D效果较好，既可有效抑制息半夏组培苗污染的常见病毒，又不影响组培苗的生长。

表3 化学物质对息半夏组培污染菌的抑制效果

2.4 半夏脱毒苗的移栽

2.4.1 实验室移栽 当脱毒苗长到5cm左右时进行移栽，先打开瓶盖炼苗2～3d，多次冲洗脱毒苗根部直至培养基完全去除，移植到托盘中，并定期加入移植液，成活率高达80%以上。试验表明：定植适合于春秋两季，植物成活率明显提高；夏季由于高温高湿，容易造成污染，植物的成活率显著降低；冬季温度降低，植株生长缓慢。

2.4.2 防虫网棚保护移栽 将实验室练好的脱毒苗进入大棚栽培，用土盖实根部，用多菌灵800倍液水浇透，再用拱棚覆盖保持一定的温、湿度，可得到较高移栽成活率，缩短了脱毒技术的应用进程。

3 分析与讨论

在生长过程中，半夏对病毒非常敏感，严重影响了半夏的大范围栽植。采取高温结合剥离茎尖脱毒的方法，再辅以抗生素的使用，可使去除病毒成功率高达85%以上。植物在高温条件生长加快，以顶端分生组织分裂为盛，而高温条件下病毒的活性受到抑制，抗生素的加入将进一步加强抑制，因此极大地增加了获得脱病毒植株的成功率。由于使用抗生素存在一定的不确定性，芽尖培养物通常与生产中的热处理相结合。热处理技术的主要原理是病毒加热后不稳定，活性钝化，生殖能力降低，传染性丧失，而植物细胞分裂加速，不受高温影响。 Bhardwaj等[7]发现用热空气法脱除苹果花叶病病毒，解红娥等[8]联合热处理与茎尖培养解毒法对半夏管苗进行解毒，再进行高温预处理，然后选择适当大小的茎尖进行培养，这种方法大大提高了解毒率和成活率。许多化学物质可以不同程度地抑制病毒的复制，但很难找到干扰病毒复制而不影响宿主细胞正常代谢的药物，并且在实际生产中较少使用。

半夏脱毒后的无病毒苗没有外加的抗病性，如果保存不当可以再次染上，若用合适的方法保存可以利用 5～8年。在夏季将解毒苗移栽，并且用300目昆虫网以防止螨虫进入；土壤施用高锰酸钾溶液消毒，周边环境保持整洁；同时喷施农药防治虫害。这种方法可以极大地缩短脱毒技术的应用进程，且移栽成活率也得以提升。