RORα对人胃癌细胞株AGS凋亡的影响

俞浩远 梁瑞 王晶晶 汪正广

摘要：目的  探寻维甲酸相关孤儿受体（RORα）对于人胃癌细胞AGS的凋亡的影响。方法  根据处理浓度不同将以1 μmol/L的SR001处理的AGS设为1 μmol/L浓度组，将以0.1 μmol/L的SR001处理的AGS设为0.1 μmol/L浓度组，另设溶媒组及对照组，分别给予等量的溶媒、等量喜树碱（50 μmol/L）处理。采用MTT检测化疗药物5-FU介导的细胞凋亡情况，Western blot检测细胞中磷酸化RORα（p-RORα）的表达及cleaved caspase-3的蛋白的含量并比较。结果  用RORα激动剂处理可显著增加5-FU介导的AGS细胞凋亡率，差异有统计学意义（P<0.05）;RORα激动剂处理48h后，人胃癌细胞中磷酸化RORα的表达增高，cleaved caspase-3的蛋白含量增多，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  RORα可以提高人胃癌细胞AGS5-中FU介导的细胞凋亡，具有作为化疗药物的增敏剂的潜质。

关键词：RORα;胃癌;化疗增敏剂

中图分类号：R735.2                               文献标识码：A                                   DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.16.020

文章編号：1006-1959（2019）16-0066-04

Abstract：Objective  To investigate the effect of retinoic acid-related orphan receptor （RORα） on apoptosis of human gastric cancer cell AGS. Methods  According to the treatment concentration， AGS treated with 1 μmol/L SR001 was set to a concentration of 1 μmol/L， and AGS treated with 0.1 μmol/L SR001 was set to a concentration of 0.1 μmol/L， and a solvent group and a control group were additionally provided. An equal amount of vehicle and an equal amount of camptothecin （50 μmol/L） were separately administered. MTT was used to detect 5-FU-mediated apoptosis. The expression of phosphorylated RORα （p-RORα） and cleaved caspase-3 protein were detected by Western blot.Results  Treatment with RORα agonist significantly increased the apoptosis rate of 5-FU-mediated AGS cells，the difference was statistically significant（P<0.05）. After treatment with RORα agonist for 48 h， the expression of phosphorylated RORα was increased in human gastric cancer cells，The protein content of cleaved caspase-3 increased， the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion  RORα can increase the apoptosis of human gastric cancer cell AGS5-FU， and it has the potential as a sensitizer for chemotherapy drugs.

Key words：RORα;Gastric cancer;Chemotherapy sensitizer

胃癌（gastric cancer，GC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一，全球约25%胃癌患者在中国，其发病率在男性恶性肿瘤中仅次于肺癌占第2位，在女性恶性肿瘤中居第4位，胃癌的死亡率在我国居恶性肿瘤首位[1，2]。化疗在胃癌综合治疗中发挥了重要作用，成为其治疗的主要方法之一。近年来，研究发现化疗增敏剂可提高化疗药物的疗效，为胃癌的综合治疗带来新的曙光，维甲酸相关孤儿受体（retinoid-related orphan receptors alpha，RORα）抑制结肠癌细胞增殖和乳腺癌细胞侵袭能力，但其是否具有抑制胃癌细胞增殖的作用报道罕见。以往研究显示，RORα在人正常胃组织中的表达明显高于人胃癌组织，并且随着TMN 分期增长，RORα在人胃癌组织的表达量逐渐减少[3]，本研究旨在初步探讨RORα对胃癌的影响及其可能的分子机制，用药物SR1001处理人胃癌细胞AGS，检测处理后细胞生物学行为改变，并检测Caspase-3蛋白的表达来探讨其潜在的分子机制，为应用于RORα作为临床治疗靶点提供理论依据。

1材料与方法

1.1主要材料  人胃腺癌细胞AGS购自美国模式培养物存库（American type culture collection，ATCC），RORα激动剂SR1001购于美国Cayman公司（规格：1 mg货号：10922），胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，F12培养基购自Hyclone公司，小鼠抗人单克隆抗体β-actin 购自美国Santa Cruz 公司，蛋白裂解液（Tris-HCl、pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%Triton，0.1% SDS，5 mg/ml Leupeptin，1 mmol/L PMSF），MTT细胞凋亡试剂盒購自Beyotime公司。

1.2细胞培养  AGS培养于含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素及链霉素）的F12培养基中，培养条件为37℃，5%CO2、饱和湿度，每2 d更换1次培养基，并种植于6孔板中，细胞密度为1×106/2 ml。根据处理浓度不同分组，将以1 μmol/L的SR001处理的设为1 μmol/L浓度组，将以0.1 μmol/L的SR001处理的设为0.1 μmol/L浓度组;另设溶媒组及对照组，分别给予等量的溶媒、等量的喜树碱（50 μmol/L）。

1.3 MTT试剂盒检测RORα对胃癌细胞凋亡的影响  取经培养好的AGS，消化后进行细胞浓度检测，并用培养基调整至5000 个/100μl;加入96孔板中，SR1001 1 μmol/L浓度组，0.1 μmol/L浓度组及溶媒组每孔加入10 μl的5-FU（10 μg/ml），对照组每孔加入对照药物（50 μmol/L喜树碱），PBS封闭周围一圈，每孔加入10 μl配制好的MTT溶液，轻轻混匀，培养箱中孵育4 h后取出，再给予每孔加入100 μl试剂盒中的Formazen溶解液，轻柔混匀继续放置培养箱中孵育4 h，使用普通光学显微镜下观察，当紫色结晶全部溶解后，采用酶标仪在570 nm测定吸光度值，以上实验重复3次。

1.4 Western blot检测蛋白表达  根据不同的处理方法将AGS细胞分组，分别为SR1001 1 μmol/L浓度组，0.1 μmol/L浓度组及溶媒组。细胞处理24h后用PBS 洗3遍，用细胞刮刮下培养瓶中的细胞，并用移液枪把液体吸到标记好的1.5 ml EP管中，每瓶加入蛋白裂解液100 μl，放置于冰上裂解30 min，每10 min振荡混匀1次，4 ℃高速冷冻离心机以14000 r/min离心30 min吸取上清液，加入蛋白上样缓冲液，充分混匀，于沸水中煮沸10 min后置-80℃保存。根据BCA蛋白定量，每组取含有等量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭2 h 后，用含0.05% Tween-20 的TBS 洗膜3遍，分别加入Caspase-3、β-actin抗体4℃孵育过夜，再用含0.05% Tween-20 的TBS 洗膜3遍后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，TBS洗膜3次，ECL发光试剂盒显影。用软件image J测定各条带的灰度值，以β-actin 为参照，计算相对条带的灰度值。以上实验重复3次。

1.5观察指标  观察MTT检测化疗药物5-FU介导的细胞凋亡情况，AGS细胞中磷酸化RORα（p-RORα）的表达及cleaved caspase-3的蛋白的含量并比较。

1.6统计学处理  采用SPSS 18.0统计软件进行分析，计量资料使用（x±s）表示，采用单因素方差分析（oneway-ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 RORα激动剂对AGS细胞中RORα磷酸化的影响  采用Western blot检测细胞中磷酸化RORα（p-RORα）的表达结果显示，与溶媒组比较，SR1001可以增强AGS细胞中p-RORα蛋白的表达，见图1A，并采用image J检测相关条带的灰度值的相对百分比，其差异有统计学意义（P<0.05），见图1B。

2.2 RORα激动剂对5-Fu介导的细胞凋亡率的影响  RORα激动剂处理显著增加5-FU介导的AGS细胞凋亡，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

2.3 RORα对细胞中凋亡蛋白的影响   RORα激动剂处理后cleaved caspase-3水平增加，见图3A。 ImageJ软件测量图3A中 cleaved caspase-3条带的灰度值并计算其相对于溶媒组的百分比，其差异有统计学意义（P<0.05），见图3B。

3讨论

RORs是核受体的一个家族，是细胞内转录因子的一员。RORs 包括RORα（NR1F1）， RORβ（NR1F2）及RORγ（NR1F3）三个成员，RORα最早于上世纪九十年代被发现，因结构与维甲酸受体及维甲类X受体相似而得名[4]，之后RORβ和RORγ被依次发现。RORα、RORβ及 RORγ在不同种属及不同组织中表达不同，RORα广泛分布于肝脏、骨骼肌、皮肤、脂肪组织、肾脏、胸腺及脑组织中，RORα有α1、α2、α3、α4四种亚型，在鼠类中仅存在α1和α4两种亚型[5，6];RORβ有β1，β2两种亚型，只有β1亚型存在人类中，RORβ的表达与神经系统相关，分布于脑及视网膜。RORγ有γ1，γ2两种亚型，分布于免疫系统，RORγ2高度表达于胸腺组织，故也常被称为RORγt。RORs能识别特定的DNA序列（通常由TAAA/ TNTAGGTCA组成），即ROR反应元件（RORE），作为单体与之结合，而不像大多数受体以二聚体形式结合，这也是其被称为孤儿受体的原因。

RORα广泛分布于组织中，被称为生物节律，脂质代谢和免疫炎症反应的调节剂。研究表明RORα可能在癌症发展中起作用，肿瘤微环境在结直肠癌中至关重要。RORα抑制结肠直肠癌细胞增殖，迁移和诱导血管生成，是通过影响脂肪细胞的方式来介导[7]，有研究表明，与癌旁组织相比，在肝癌细胞中存在RORα低表达的情况，并且这种表达与肿瘤的临床病理特征有相关性，低RORα表达的肝癌患者具有较高的AFP水平，较差的病理学分级，肿瘤复发和血管侵入的倾向。然而，在RORα表达与年龄，性别，乙型肝炎血清抗原（HBsAg）状态，肿瘤大小或肝硬化之间未观察到统计学上显着的相关性。此外，RORα与肿瘤患者预后有关，低RORα表达的患者具有比高表达的患者总体生存率更低，无病生存时间更短[8]。

有研究显示RORα参与前列腺素介导的Wnt信号传导，并且似乎更像是是中心分子开关[9，10]。在肝细胞肝癌中，约65%的患者存在RORα低表达，且其总体生存率和无病生存时间更短[8]，另外RORα高表达可抑制胃癌细胞MGC803细胞增殖与迁移侵袭，将细胞阻滞于G2/M期，其机制可能与下调MMP-9和上调TIMP3有关[11]。本研究中采用RORα激动剂SR1001来提高RORα的磷酸化，并采用MTT试剂盒检测其对细胞凋亡的影响发现，相对于溶媒组，提高RORα的磷酸化后，5-FU介导的细胞凋亡率增加，并且相关凋亡蛋白含量增高，表明RORα可以增加5-FU介导的胃癌细胞的凋亡。

综上所述，RORα可以增加5-FU介导的胃癌细胞的凋亡，具有作为5-FU化疗药物的增敏剂的潜质，为研发新型的化疗药物或增敏剂提供新的思路。

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收稿日期：2019-5-25;修回日期：2019-7-3

编辑/肖婷婷