浅析植物系统学中叶绿体基因组分析技术的应用

摘 要：本文主要介绍了植物细胞内叶绿体基因组，包含叶绿体基因组发现、特点以及结构、进化特点编码基因与遗传方式。讲述了DNA杂交、DNA限制酶谱分析、BFLP的分析等多项技术的特点、原理以及应用。讲述植物细胞内叶绿体DNA在植物系统学当中的应用，以及广泛应用使存在的优点和缺点。

关键词：叶绿体基因组;植物系统学;DNA分析技术

中图分类号：S-3

文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20190815010

引言

随着科技的不断进步，生物技术也在不断的朝着新的方向进行革新和改进，能够更好地帮助人们对大片段的DNA分子进行分析。在科技手段不断进步的影响下，近些年通过对比DNA来研究系统发育的问题已经成为一门专业的学科[CD1*2]分析系统学。叶绿体基因组具有易分析以及保守性的特点，研究人员在对系统发育的研究过程中经常使用cpDNA，对叶绿体分子系统学的研究也飞速兴起。本文主要就是讲述叶绿体基因组分子技术以及该项技术在植物系统学当中的应用情况进行简要的概述。

1 叶绿体基因组简介

1.1 发现

Ris在1962年用电子显微镜观察玉米和衣藻等植物时发现叶绿体内部有DNA纤维，证实了叶绿体内部存在DNA分子。

1.2 结构以及特点

植物细胞内的cpDNA分子长度约为120～160kb。多数DNA分子是闭合共价双链形状，极少数是线状。

1.3 编码基因

叶绿体基因组编码了自己所有使用的tRNA以及rRNA，叶绿体细胞内有数百种蛋白质及多肽但只编码一小部分。大多数的蛋白复合体需要核基因组与叶绿体基因组一起编码完成。

1.4 进化的特点

陆地植物的cpDNA各个方面的进化速度十分缓慢，表现为：全部陆生植物的叶绿体基因组的大小、编码基因排列顺序以及数目顺序;细胞器叶绿体的编码基因高度保守。

2 叶绿体基因组技术以及该技术在遗传方式当中属于单亲遗产

2.1 DNA的杂交技术

DNA的杂交是不同来源DNA经过解链后互补配对的DNA部分重新退火或者联合的过程。DNA溶解温度和2条子链的互补性成正比，杂交的DNA分子比同源的DNA分子的Tm值低，对同源DNA分子和杂交DNA进行Tm值的对比，可以推测分类群DNA间共同的序列区域占据的比重，从而判断亲缘的关系。在很久之前cpDNA就已经证明，所有的双子叶植物，叶绿体细胞器中的基因组在各科间有同样的差异。但是DNA杂交技术实施起来较复杂，获得的结果不是十分准确，有诸多不确定因素，需要大量DNA，因此这项技术被cpDNA技术取代。

2.2 DNA限制酶谱分析

DNA限制酶谱分析是指DNA分子上全部的酶切点所在的位置图。植物的种属之间品种之间同源的DNA序列上针对不同的限制酶识别的位置也不尽相同，把纯化后的DNA分子使用不同的限制性内切酶对其进行切割，然后进行凝胶电泳分析。对cpDNA要求找到对该DNA分子仅有1个切点的内切酶，用这个作为参考点，依据图谱上酶切段的长度，找到各个切点的位置，并用简图表示。这样做在遗传学中有着非常重要的意义。

2.3 BFLP的分析

限制酶合理的将DNA分子切割成不同的额片段，片段的大小直接影响着自身在电泳中游动的速度，在凝胶之上形成连续的涂片，经过杂交、放射自显影之后就可以得到DNA限制性的片段也就是RELP。该分析方法主要原理就是植物的长期进化获得的结果，在种属之间甚至是品种之间限制酶的酶切位点大不相同，部分原因就是点发生重组或者突变，造成酶切点处的核苷酸出现插入、缺失以及替换进而无法识别并切割。

自从20世纪80年代以来，发现了更多的cpDNA种内多态性的案例，比如wattier等研究人员使用标记的总cpDNA来做探针，对2种红藻做了RFLP分析，在实验的过程中发现了cpDNA中存在多态性，并且在种的水平之上开展其系統发育的研究。

2.4 核苷酸序列的分析

核苷酸分子不单是指导生物的个体发育以及形态建设，还可以反应生物间的亲缘关系，当前的生物分子的建设主要就是在这一原理上开展的。对DNA分子序列进行检测可以直接看出遗传物质的变异。但该项工作十分艰巨且困难，检测DNA的难易程度和成本以及片段的长度有着直接的关系，在短时间里很难广泛的应用到系统学研究当中，目前能够在植物系统学当中直接应用的只有cpDNA的几个基因序列，比如：tm基因间隔区、rbcl基因等。

2.5 DNA单链构像多态性分析

在自然状态下，单链DNA会弯曲折叠，形成一个有空间结构的结构，这种特点是由DNA链上特定的碱基顺序所决定的。在SSCP的分析过程中，先设计出特异的引物，用PCR技术对特定点的基因组进行扩增，将扩增的片段进行变性处理让其变成单链，在聚丙烯酰胺凝胶当中电泳。因为该项技术操作起来比较复杂，对操作人员的技术有着十分高的要求，因此在cpDNA系统学的研究过程中没有广泛应用。

2.6 核苷酸序列的分析

核酸分子不单指导生物的形态建成以及个体的发育，还可以反映生物间的关系，当前生物分子的系统构建，都是在这个原理上进行的。对DNA序列进行分析可以直接检测遗传物质。但是该项目完成还是很艰巨，并且DNA测序工作的成本以及难易程度和片段的长度有着密切的关系，在较短的时间里还无法应用到植物系统学的研究中，当前能够使用到系统学上的仅有cpDNA的个别基因的序列分析上。由于这个过程太过繁琐、复杂、工作量大，很难对很多个分类群测序，大大限制了叶绿体基因序列在系统发育研究上的使用。

2.7 PCR-RFLP分析

自从1990年之后，PCR技术开始主要使用在酶切产物检测上，按照保守序列而设计出可以通用的引物，然后通过PCR反应来扩增一些特定基因，最后酶切纯化扩增的片段。扩增的长度并不是很大，经过EB染色可以观察到限制性片段的长度多态性。该分析方法的优点：不需要将cpDNA进行提纯处理;不同使用放射性同位素标记，且不受半衰期的影响，对实验室的污染较轻;使用的植物材料少;对植物材料的要求不严苛;扩增后的产物特异性非常可靠。因此该项分析方法是当前使用最为广泛的技术，还是物种鉴别、遗传探究、品系鉴定以及中间杂种等多领域研究的主要工具。

2.8 微卫星序列分析

以叶绿体微卫星序列两侧共有序列当做引物队，进而在不同植物间扩增出叶绿体微卫星序列。该引物队伍一定要符合的标准：扩增的片段要有多态性;靶序列一定要有较高的保守性;扩增的片段比较短进而确保片段在测序胶上可以达到一个bp分辨率。

3 植物细胞内叶绿体DNA在植物系统学当中应用时存在的优点及缺点

3.1 优点

植物叶绿体基因组有2大特点为系统的发育提供了巨大的优势。核基因组是第1大基因组，叶绿体基因组是第2大基因组，为对比研究提供了很大的数据;cpDNA的核算置换效率适中。叶绿体基因组的非编码区以及编码区的分子进化速度差距较大，适用于多个层次的系统学研究。

3.2 缺点

CpDNA在研究系统发育时有着一定的局限性。叶绿体基因组是母系遗传，可以发现不能只单纯的依靠叶绿体基因组来结合种群之间的杂交;虽有很多的cpDNA分子被用来标记研究种群间的系统发育的关系，但是只有将片段反映出的信息和其他片段反映出的信息、生理特征以及传统的形态相结合，这样才能够越来越接近系统发育的真正面目。

参考文献

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作者简介：

张妙娟（1982-），女，硕士研究生，讲师。研究方向：植物系统学和资源开发利用研究。