肝细胞癌中microRNA-1469表达及其对肝癌细胞生物学行为的影响

王宇锋，朱怡凤，殷国志

(西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西 西安 710061)

我国肝癌发病率较高，其中约90%为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，严重影响患者的身心健康[1-2]。目前，HCC的诊断与治疗水平已经有了大幅提升，但HCC患者的整体预后仍然较差，手术仍是首选治疗方式[1，3-6]。近年来，肿瘤靶向治疗为HCC患者带来了新的曙光，microRNA是研究较多且较为深入的一类靶点[7-14]。MicroRNA是一类长度18～25个核苷酸序列的非编码单链小分子RNA，其异常表达与肿瘤的发生、发展及患者预后有密切关系[15-17]。研究发现，microRNA-1469(miR-1469)与肿瘤密切相关，在食管鳞状细胞癌、肺癌及胃癌等多种恶性肿瘤中异常表达，可作为癌基因或抑癌基因参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡等多种生物学行为，且与肿瘤患者的预后密切相关[18-20]。目前，miR-1469在HCC中的表达及其对HCC细胞增殖、细胞活力、细胞周期、细胞侵袭和迁移等的影响鲜有报道。本研究旨在探讨miR-1469表达与HCC患者临床病理特征、预后的关系及其对肝癌细胞生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源选取2010年1月至2012年12月西安交通大学第一附属医院肝胆外科手术切除的HCC组织和对应的癌旁组织(距肿瘤边缘>2 cm)标本各76例，男66例，女10例，年龄30～75岁，中位年龄49岁。所有患者术前未接受放射治疗、化学治疗及其他辅助治疗，术后经病理学检查确诊为HCC。HCC组织和癌旁组织经甲醛固定，石蜡包埋保存。所有患者术后随访36个月。本研究获得西安交通大学第一附属医院伦理委员会审核批准，患者均签署知情同意书。

1.2 细胞、试剂与仪器人正常肝细胞(LO2)及肝癌细胞HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402均购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清和达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)购自美国Gibco公司，TRIzol试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司，miRNA反转录试剂盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)、miRNA定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒(All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit)、miR-1469特异性引物、miRNA 内参U6引物、miR-1469过表达类似物(miR-1469 mimics)、miR-1469过表达类似物的阴性对照均购自美国Gene Copoeia公司，细胞计数试剂盒-8、流式细胞周期检测试剂盒均购自南京凯基生物科技股份有限公司，兔抗人NDRG1单克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体购自美国Abcam公司，二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒购自美国Milipore公司；实时荧光定量PCR仪(CFX96)、全自动凝胶电泳分析系统(170-8265)购自美国Bio-rad公司，Transwell小室购自美国Corning公司，倒置相差显微镜购自上海绘统光学仪器有限公司，流式细胞仪(FACSCanto II)购自美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实时荧光定量PCR检测HCC组织、癌旁组织以及LO2、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402细胞中miR-1469的表达应用TRIzol提取RNA技术按照TRIzol试剂说明书步骤提取收集HCC组织、癌旁组织和LO2、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402细胞中的总RNA，当RNA样品的核酸在260 nm处的吸光度值与蛋白质在280 nm处的吸光度值的比值在1.8～2.0时，样品合格。按照miRNA反转录试剂盒说明书对RNA样品进行反转录。20 μL反转录体系：总RNA 4 μL，Reaction Mix(5×)1 μg，SuperScript Enzyme Mix(10×)2 μL，然后加入焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水补足至20 μL，混匀，离心。反应条件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，然后置于4 ℃冰箱保存备用。依照miRNA实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作。20 μL反应体系：EXPRESS SYBR Green ERTM qPCR Super Mix 10 μL，10 μmol·L-1miR-1469特异性引物或内参U6引物0.4 μL，10 μmol·L-1通用qPCR引物0.4 μL，荧光定量PCR参比染料 0.04 μL，cDNA 2 μL，DEPC处理水7.16 μL，混匀，离心。每个样本均做3个复孔。反应条件：50 ℃预孵育2 min，95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，扩增40个循环。60 ℃延伸时采集荧光信号，反应结束后直接得到样本的域值循环数，应用2-△△CT法处理数据。小核RNA U6为内参。每个独立实验重复3次。引物序列：miR-1469上游引物序列为5′-ACACTCCAGCTGGGCTCGGCGCGGGGCGCG-3′，下游引物序列为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-CAATTCAGTTGAGGGAGCCCG-3′；U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.2 细胞培养及Hep3B和SMMC-7721细胞转染将Hep3B和SMMC-7721细胞置于含体积分数10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的DMEM中，于37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱内培养。取对数生长期的Hep3B或SMMC-7721细胞，胰蛋白酶消化、离心、重悬、计数，接种于6孔板(每孔1.5×105个细胞)中继续培养，待细胞融合度达70%时将Hep3B细胞分为miR-1469 mimics组和miR-1469 control mimics组，利用Lipofectamine 2000转染试剂盒将miR-1469 mimics和对应的阴性对照转染至miR-1469 mimics组和miR-1469 control mimics组Hep3B细胞；将SMMC-7721细胞分为miR-1469 inhibitors组和miR-1469 control inhibitors组，利用Lipofectamine 2000转染试剂盒将miR-1469 inhibitors(anti-miR-1469)和对应的阴性对照转染至的miR-1469 inhibitors组和miR-1469 control inhibitors组SMMC-7721细胞。转染后继续培养48 h，然后进行后续实验。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测转染后Hep3B和SMMC-7721细胞中miR-1469表达Hep3B和SMMC-7721细胞转染48 h后应用TRIzol提取细胞总RNA，采用紫外分光光度计测定其纯度及浓度，确保RNA样品的核酸在260 nm处的吸光度值与蛋白质在280 nm处的吸光度值的比值在1.8～2.0，然后置于-80 ℃保存备用。应用miRNA反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，20 μL反转录体系如下：总RNA 1 μg，Reaction Mix(5×)4 μL，Super Script Enzyme Mix(10×)2 μL，然后加入DEPC水补足至20 μL，混匀，离心。反应条件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，然后置于4 ℃冰箱保存备用。依照miRNA实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作。20 μL反应体系：EXPRESS SYBR Green ERTM qPCR Super Mix 10 μL，10 μmol·L-1miR-1469特异性引物或内参U6引物0.4 μL，10 μmol·L-1通用qPCR引物0.4 μL，荧光定量PCR参比染料 0.04 μL，cDNA 2 μL，DEPC处理水7.16 μL，混匀，离心。每个样本均做3个复孔。反应条件：50 ℃预孵育2 min，95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃ 退火延伸1 min，扩增40个循环。60 ℃延伸时采集荧光信号，反应结束后直接得到样本的域值循环数，应用2-△△CT法处理数据。小核RNA U6为内参。每个独立实验重复3次。引物序列：miR-1469上游引物序列为5′-ACACTCCAGCTGGGCTCGGCGCG-GGGCGCG-3′，下游引物序列为5′-CTCAACTGG-TGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGAGCCCG-3′；U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.4 四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法检测转染后Hep3B和SMMC-7721细胞的增殖能力取各组转染后48 h的Hep3B和SMMC-7721细胞接种于96孔板，每孔1.5×104个细胞，每组设3个复孔，于培养24、48、72 h每孔加入20 μL MTT溶液，继续孵育4 h后每孔加入150 μL二甲基亚砜终止反应。在酶联免疫检测仪上读取490 nm处各孔的吸光度值，每组设3个复孔，取均值，并以时间为横坐标、抑制率为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.3.5 平板克隆形成实验检测转染后Hep3B和SMMC-7721细胞克隆能力取各组转染后48 h细胞，经消化、离心、重悬、计数后接种于6孔板中，每孔300个细胞，每组设3个复孔，轻轻摇晃培养板使细胞分散均匀。将培养板置于37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中培养，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时(约2周)终止培养，弃去培养液，使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)小心冲洗3次，甲醇固定15 min；然后，应用结晶紫对细胞进行染色30 min，用流水缓慢漂洗去除染色液，自然风干。观察细胞克隆形成情况，50个细胞以上的细胞集落作为1个克隆，计算克隆形成数。

1.3.6 流式细胞术检测转染后Hep3B和SMMC-7721细胞周期细胞周期检测按照细胞周期试剂盒说明书步骤进行。取各组转染后48 h细胞，预冷的PBS洗涤、离心、重悬，将细胞加入预冷的体积分数70%乙醇中固定、4 ℃过夜。次日，离心后去除乙醇，PBS洗涤、重悬，加入核糖核酸酶(终质量浓度为100 mg·L-1)，37 ℃水浴30 min，加入400 μL碘化丙啶(终质量浓度为50 mg·L-1)，4 ℃避光染色 30 min，使用流式细胞仪检测细胞周期，细胞周期拟合软件分析数据。

1.3.7 Transwell实验检测转染后Hep3B和SMMC-7721细胞的侵袭与迁移能力取各组转染后48 h细胞，将细胞进行消化、离心，用无血清培养基进行重悬，调整细胞浓度为2×108L-1，取100 μL接种于Transwell上室(侵袭实验的上室平铺Matrigel胶，迁移实验的上室未铺Matrigel胶)，下室加入700 μL含体积分数10%胎牛血清的培养基，置于培养箱中继续培养24 h后取出小室，用棉签拭掉上室内残留的细胞，40 g·L-1多聚甲醛固定，1 g·L-1结晶紫染色，显微镜下随机选取5个视野(×100)计数穿膜细胞数，实验重复3次，取均值。

1.3.8 Western blot法检测转染后Hep3B和SMMC-7721细胞中NDRG1蛋白表达取各组转染后48 h细胞，弃培养基，0.01 mol·L-1PBS冲洗3次，加入细胞裂解液充分裂解，15 000 r·min-1离心15 min后取上清液，二奎啉甲酸法测定总蛋白浓度。电泳前将蛋白样品按5：1比例加入6×上样缓冲液，煮沸5 min后即用120 g·L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳。4 ℃条件下23 V电压湿转12 h。50 g·L-1脱脂奶粉(三乙醇胺缓冲盐水溶液溶解)室温封闭 1 h 后加入1：1 000稀释的NDRG1一抗及β-actin一抗，4 ℃孵育过夜，含Tween-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液漂洗6次，每次5 min，加入二抗(按 1：10 000 稀释)，室温孵育1 h。Tween-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液漂洗6次，每次5 min。暗室内浸入ECL液显色，胶片曝光，洗片。利用ImageJ图像分析软件对各条带灰度值进行分析，获得细胞中NDRG1蛋白相对表达量。每个实验重复3次。

2 结果

2.1 HCC组织和癌旁组织中miR-1469的表达miR-1469在HCC组织和癌旁组织中的相对表达量分别为0.71±0.03、5.49±0.04，HCC组织中miR-1469相对表达量显著低于癌旁组织，差异有统计学意义(t=40.640，P<0.05)。

2.2 MiR-1469表达与HCC患者临床病理特征的关系结果见表1。根据76例HCC组织中miR-1469的平均表达水平(0.71±0.03)，将高于平均表达水平的HCC患者纳入miR-1469高表达组(n=33)，将低于平均表达水平的患者纳入miR-1469低表达组(n=43)。miR-1469表达与肿瘤直径、肿瘤数目、TNM分期、组织分化程度及微血管侵犯相关(P<0.05)，与患者的年龄、性别、血清甲胎蛋白水平、静脉侵犯、Edmondson病理分级、肿瘤部位无相关性(P>0.05)。

表1 MiR-1469表达与HCC患者临床病理特征的关系

2.3 MiR-1469表达与HCC患者预后的关系结果见图1。Kaplan-Meier生存分析显示，miR-1469高表达HCC患者的3 a总体生存率显著高于低表达者(χ2=3.942，P<0.05)。

2.4 LO2、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402细胞中miR-1469表达miR-1469在LO2、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402细胞中的相对表达量分别为1.01±0.02、0.45±0.01、0.05±0.01、0.61±0.02、0.14±0.01、0.29±0.02；miR-1469在HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402细胞中的相对表达量显著低于LO2细胞，差异均有统计学意义(t=20.370、38.490、12.320、31.650、24.840，P<0.05)；其中Hep3B细胞中miR-1469表达量最低，SMMC-7721细胞中miR-1469表达量最高。

2.5 转染后Hep3B和SMMC-7721细胞中miR-1469表达miR-1469 mimics组和miR-1469 control mimics组Hep3B细胞中miR-1469相对表达量分别为4.47±0.15、0.05±0.01，miR-1469 mimics组Hep3B细胞中miR-1469相对表达量显著高于miR-1469 control mimics组，差异有统计学意义(t=30.320，P<0.05)。miR-1469 inhibitors组和miR-1469 control inhibitors组SMMC-7721细胞中miR-1469相对表达量分别为0.20±0.11、1.00±0.00，miR-1469 inhibitors组SMMC-7721细胞中miR-1469相对表达量显著低于miR-1469 control inhibitors组，差异有统计学意义(t=35.470，P<0.05)。

2.6 MiR-1469对Hep3B和SMMC-7721细胞增殖及克隆能力的影响结果见表2、表3和图2。培养24、48、72 h时，miR-1469 mimics组Hep3B细胞增殖能力显著低于miR-1469 control mimics组，miR-1469 inhibitors组SMMC-7721细胞增殖能力显著高于miR-1469 control inhibitors组，差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-1469 mimics组和miR-1469 control mimics组Hep3B细胞的克隆数分别为17.00±1.73、65.67±2.33，miR-1469 mimics组Hep3B细胞克隆形成能力显著低于miR-1469 control mimics组，差异有统计学意义(t=16.750，P<0.05)；miR-1469 inhibitors组和miR-1469 control inhibitors组SMMC-7721细胞的克隆数分别为93.00±2.08、27.67±1.45，miR-1469 inhibitors组SMMC-7721细胞的克隆形成能力显著高于miR-1469 control inhibitors组，差异有统计学意义(t=25.740，P<0.05)。

表2 过表达miR-1469对Hep3B细胞增殖能力的影响

表3 下调miR-1469表达对SMMC-7721细胞增殖能力的影响

A：miR-1469 control mimics组；B：miR-1469 mimics组；C：miR-1469 control inhibitors组；D：miR-1469 inhibitors组。

2.7 MiR-1469对Hep3B和SMMC-7721细胞周期的影响结果见表4和表5。与miR-1469 control mimics组比较，miR-1469 mimics组G1期Hep3B细胞显著增多，S期Hep3B细胞显著减少，差异有统计学意义(t=20.200、23.480，P<0.05)；但2组G2期细胞比例比较差异无统计学意义(t=0.633，P>0.05)。与miR-1469 control inhibitors组比较，miR-1469 inhibitors组G1期SMMC-7721细胞显著减少，S期SMMC-7721细胞显著增多，差异有统计学意义(t=4.413、6.379，P<0.05)；但2组G2期SMMC-7721细胞比例比较差异无统计学意义(t=2.214，P>0.05)。

表4 过表达miR-1469对Hep3B细胞周期的影响

表5 MiR-1469表达下调对SMMC-7721细胞周期的影响

2.8 MiR-1469对Hep3B和SMMC-7721细胞迁移和侵袭能力的影响结果见图3。miR-1469 mimics组Hep3B细胞迁移数和侵袭数分别为59.00±2.08、29.00±2.08，miR-1469 control mimics组Hep3B细胞迁移数和侵袭数分别为35.00±1.53、20.33±1.45；miR-1469 mimics组Hep3B细胞的迁移和侵袭能力显著高于miR-1469 control mimics组，差异有统计学意义(t=9.295、3.414，P<0.05)。miR-1469 inhibitors组SMMC-7721细胞迁移数和侵袭数分别为26.00±1.16、17.33±0.88，miR-1469 control inhibitors组SMMC-7721细胞迁移数和侵袭数分别为56.33±3.18、44.67±1.45；miR-1469 inhibitors组SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力显著低于miR-1469 control inhibitors组，差异有统计学意义(t=8.966、16.080，P<0.05)。

2.9 miR-1469对Hep3B和SMMC-7721细胞中NDRG1蛋白表达的影响结果见图4。miR-1469 mimics组和miR-1469 control mimics组Hep3B细胞中NDRG1蛋白相对表达量分别为0.23±0.04、1.00±0.00，miR-1469 mimics组Hep3B细胞中NDRG1蛋白相对表达量显著低于miR-1469 control mimics组，差异有统计学意义(t=17.760，P<0.05)；miR-1469 inhibitors组和miR-1469 control inhibitors组SMMC-7721细胞中NDRG1蛋白相对表达量分别为3.90±0.17、1.00±0.00，miR-1469 inhibitors组SMMC-7721细胞中NDRG1蛋白相对表达量显著高于miR-1469 control inhibitors组，差异有统计学意义(t=16.740，P<0.05)。

A：miR-1469 control mimics组；B：miR-1469 mimics组；C：miR-1469 control inhibitors组；D：miR-1469 inhibitors组。

1：miR-1469 control mimics组；2：miR-1469 mimics组；3：miR-1469 control inhibitors组；4：miR-1469 inhibitors组。

3 讨论

HCC是原发性肝癌的主要组织学类型，是最常见的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和致死率，因此，提高HCC的诊断与治疗水平具有重要意义[21-23]。近年来，以microRNA为代表的靶点是研究热点之一[24-26]。MicroRNA主要通过与靶mRNA的3′端非编码区域(3′-untranslated region，3′-UTR)互补配对而在转录后水平对基因的表达进行负调控，导致mRNA降解或翻译抑制[17]。随着研究的不断深入，发现异常表达的microRNA与多种肿瘤的发生、发展密切相关。研究发现，miR-1469在食管鳞状细胞癌、肺癌及胃癌等多种恶性肿瘤中存在异常表达，可作为癌基因或抑癌基因参与调节肿瘤细胞的增殖、凋亡等多种生物学行为，且与肿瘤患者的预后密切相关，对判断肿瘤的恶性程度及患者预后具有一定的临床参考价值[18-20]。

本研究结果显示，miR-1469在HCC组织和细胞中的表达均显著下调，且与肿瘤直径、肿瘤数目、TNM分期、组织分化程度及微血管侵犯显著相关，miR-1469低表达HCC患者的3 a总体生存率显著低于高表达者；该结果提示，miR-1469可能是HCC的抑癌基因，对判断HCC的恶性程度及患者预后具有一定的临床参考价值。本研究结果显示，上调HCC细胞中miR-1469表达水平后，HCC细胞的活力、克隆形成能力、细胞周期及细胞侵袭、迁移能力均受到显著抑制；而下调HCC细胞中miR-1469表达水平后，上述生物学功能明显增强；该结果表明，miR-1469高表达可抑制HCC细胞的增殖能力，诱导肿瘤细胞的细胞周期阻滞，并抑制HCC细胞的侵袭、迁移能力；miR-1469为HCC的抑癌基因，可以通过抑制HCC细胞的增殖、细胞周期、侵袭及迁移而发挥其抗肿瘤作用。

为进一步探究miR-1469的作用机制，本研究应用生物信息学数据库(http：//www.microrna.org/microrna/home；http：//www.targetscan.org)预测miR-1469的下游靶点，发现NDRG1是上述数据库共同预测的靶点之一。NDRG1的3′-UTR具有与miR-1469结合的区域，已证实NDRG1为HCC的促癌基因。本研究结果显示，过表达Hep3B细胞中的miR-1469后，NDRG1的表达水平明显下调；而抑制SMMC-7721细胞中的miR-1469的表达后，NDRG1的表达水平显著上调；该结果提示，HCC细胞中的NDRG1可能为miR-1469的作用靶点。有研究表明，HCC细胞中过表达的NDRG1能够竞争性结合GSK-3β和Nur77，从而减少β-catenin的降解，进而激活Wnt/β-catenin通路[27]。笔者推测，HCC细胞中miR-1469能够通过靶向结合并降低NDRG1表达，从而促进β-catenin的降解，抑制Wnt/β-catenin通路，进而抑制HCC进展；但其具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，miR-1469在HCC中表达下调，且与肿瘤数目、肿瘤直径、TNM分期、组织分化程度、微血管侵犯及患者预后密切相关；miR-1469可以通过靶向结合NDRG1并抑制其表达从而抑制HCC细胞的增殖、周期、侵袭和迁移。本研究为进一步了解HCC发生、发展的分子机制及寻找新的分子治疗靶点奠定了一定的基础。