乙酰肝素酶及新生血管在人颈动脉粥样硬化斑块中的表达

徐斌 石祥恩 李敏 陈伟东 康更洁 杜铁英 魏娟

颈动脉粥样硬化易损斑块的破裂是导致缺血性卒中的重要致病因素之一[1-2]。易损斑块的破裂机制十分复杂，是斑块内部组织学特征及微环境下物理性、化学性、免疫性、缺氧或慢性感染等各种因素共同作用的结果[3]。病理学研究提示，斑块内新生血管的存在和程度与斑块的破裂及临床脑血管事件相关，其为不稳定性动脉粥样硬化易损斑块的预测指标之一[4]。我们前期采用超声造影技术观察41例颈动脉粥样硬化患者斑块内新生血管，研究结果提示，不同性质的斑块内均存在新生血管[5-7]。

动脉粥样硬化斑块内病理性新生血管产生的机制尚未明确。在对肿瘤及子宫内膜异位症等的研究中发现，乙酰肝素酶(Heparanase，Hpa)通过释放血管活性因子参与血管新生[8-11]。实验研究提示，动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞可分泌Hpa，其与动脉粥样硬化斑块的产生和进展密切相关[12-13]。Hpa可通过降解内皮细胞下的基底膜和细胞外基质，促进内皮细胞的迁移，同时释放一系列血管生长因子，诱导血管生成及内皮细胞的增殖，为血管生成创造条件[14-15]。Hpa参与人体动脉粥样硬化斑块内血管新生的研究较少，因此，本研究拟探讨动脉粥样硬化斑块内Hpa及新生血管的表达。

1 对象与方法

1.1 对象

回顾性连续纳入2014年12月至2017年12月首都医科大学附属复兴医院神经外科接受颈动脉内膜切除术治疗的颈内动脉系统粥样硬化性狭窄患者55例(动脉粥样硬化组)，诊断符合颈动脉狭窄诊治指南[16]，经血管超声、CT血管成像和(或)DSA等影像学方法证实。动脉粥样硬化组中，男45例，女10例；年龄54～75岁，平均(65±9)岁；缺血性卒中47例，短暂性脑缺血发作8例；临床表现为肢体无力18例、肢体麻木10例、吞咽困难5例、言语不清3例、视物模糊3例、口角歪斜3例、头痛2例、头晕19例、黑曚2例、失语2例；合并高血压病20例，糖尿病13例，脂代谢异常18例。选择同期北京大学医学部病理学系行尸体解剖并明确无颈动脉粥样硬化病变者15例(无动脉粥样硬化组)，其中男12例，女3例；年龄16～58岁，中位年龄40(24，50)岁。本研究经首都医科大学附属复兴医院伦理委员会审查通过(2014FXHEC-KY069)，患者或其家属均签署了手术知情同意书。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1动脉粥样硬化组纳入标准：单侧或双侧颈动脉粥样硬化性狭窄；DSA结果示颈动脉狭窄率≥70%[16]；患者或家属对颈动脉内膜切除术的风险知情并签署了知情同意书。

1.2.2动脉粥样硬化组排除标准：有严重的出血倾向；同侧颈动脉系统多部位狭窄，远端狭窄且手术无法达到；颈动脉支架术及切除术后再狭窄患者；合并颅内动脉瘤并有破裂的可能；合并严重手术禁忌证；除外椎-基底动脉系统病变；合并其他恶性疾病，预期存活<1年者。

1.2.3无动脉粥样硬化组纳入标准：既往无动脉粥样硬化病史；因车祸死亡，冰冻48 h～7 d行尸体解剖，死者家属自愿同意采集死者颈动脉标本，并签署了尸解知情同意书。

1.2.4无动脉粥样硬化组排除标准：动脉粥样硬化高危人群；死者家属拒绝提供颈动脉标本者。

1.3 标本收集及判读标准

颈动脉粥样硬化斑块剥离30 min内进行取材。于动脉粥样硬化病变最明显处，根据斑块形态及大小沿纵轴或横轴方向切取0.2 cm×0.5 cm×0.5 cm的组织，立即放入4%甲醛溶液中固定，固定24 h后进行石蜡包埋，以4 μm厚度切片，室温保存。尸检标本切片制作按常规方法进行石蜡包埋，以4 μm厚度切片，室温保存。根据文献[14-15]的组织病理学分型方法，筛选出结构清楚的晚期动脉粥样硬化斑块(Ⅳ～Ⅵ型)作为动脉粥样硬化组的研究石蜡组织样本(共73个)。Ⅳ型指细胞外脂滴聚积成为较大的脂质核心；Ⅴ型是在有较大脂质核心的基础上，出现一个厚的纤维帽，纤维帽向管腔内凸起，可细分为多种亚型，包括Ⅴa(存在多个脂质核心和纤维结缔组织)、Ⅴb(脂质核心或病变的其他组织结构出现钙化)和Ⅴc(病变含有的脂质很少，而含有纤维组织)；Ⅵ型是指上述病变出现出血、血肿等继发性病理变化，其中Ⅵa为出现斑块断裂，Ⅵb为出现血肿，Ⅵc为出现血栓。根据Naghavi等[17]提出的形态学分型标准，在显微镜下，将动脉粥样硬化斑块组的73个石蜡组织样本分为易损斑块(42个)和移形斑块(31个)；将显微镜下明确无动脉粥样硬化病变者定义为正常动脉段标本(15个)。满足以下1项以上特征即定义为易损斑块，余为移形斑块，无以下特征者为无动脉粥样硬化病变。主要标准包括：(1)斑块内活动性炎性反应；(2)脂质核心超过斑块体积的40%或脂质核心较小但伴有纤维帽厚度在100 μm以下的斑块；(3)内皮细胞脱落伴表层血小板聚集；(4)裂隙斑块与受损斑块；(5)严重狭窄。次要标准包括：(1)浅表钙化结节；(2)黄色斑块；(3)斑块内出血；(4)内皮功能异常；(5)正性重构。

1.4 Hpa检测试剂及方法

切片分别行常规苏木素-伊红、免疫组织化学(通用型二步法)及免疫荧光染色。兔抗人Hpa单克隆抗体 (sc-25825)购自美国Santa Cruz公司，小鼠抗人CD34单克隆抗体购自美国Abcam公司；山羊抗小鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶多聚体二抗、二氨基联苯胺显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚荧光发光液、荧光二抗Cy5标记的山羊抗小鼠IgG(红色荧光染料)、Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG(绿色荧光染料)及封片剂均购自美国Life Technologies公司。荧光染料聚乙二醇辛基苯基醚购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

免疫组织化学采用通用型二步法，均严格按试剂盒操作步骤进行。Hpa、CD34单克隆抗体工作浓度分别为1∶200和1∶50，每次染色均设对照作为染色质量控制标准，用已知阳性颈动脉粥样硬化组织切片作阳性对照，0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液取代一抗作阴性对照。通用型二步法染色，Hpa阳性表达为细胞质及细胞膜内出现棕黄色颗粒。光学显微镜下观察所有样本切片免疫组织化学染色情况，记录各切片染色结果；分别统计易损斑块、移形斑块、无动脉粥样硬化组样本切片Hpa、CD34、免疫组织化学染色阳性例数。

免疫荧光染色均严格按试剂盒操作步骤进行，Hpa、CD34单克隆抗体工作浓度分别为1∶500和1∶50，每次染色均设对照作为染色质量控制标准，荧光显微镜观察。Hpa抗体免疫荧光染色阳性为细胞质及细胞膜内出现红色荧光物质，CD34抗体免疫荧光染色阳性为在动脉粥样硬化斑块内可见呈绿色荧光染色的新生微血管内皮细胞。分别记录易损斑块、移形斑块及正常颈动脉段样本切片Hpa、CD34免疫荧光染色阳性例数。新生微血管判断标准：单个或成丛阳性血管内皮细胞，不管成腔与否均视为单个微血管，但管径>8个红细胞或有肌层的血管不记为新生微血管[14]。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 Hpa在颈动脉斑块组织及正常动脉组织中的表达

图1为采集的颈动脉粥样硬化斑块大体标本。苏木素-伊红染色结果显示，颈动脉粥样硬化斑块内可见巨噬细胞浸润，其中有大量蓝染的巨噬细胞核(图2a)；免疫组织化学染色结果显示，颈动脉粥样硬化斑块内可见Hpa呈阳性表达，棕色颗粒主要位于巨噬细胞细胞质内(图2b)；抗体免疫荧光染色结果显示，斑块内Hpa阳性表达呈红色荧光物质，细胞核呈蓝色(图2c，2d)，在动脉粥样硬化斑块内可见呈绿色荧光染色的新生微血管内皮细胞(图2e)。正常动脉组织中无Hpa表达(图3)。

2.2 不同形态颈动脉粥样硬化斑块内Hpa阳性表达率比较

颈动脉粥样硬化斑块内Hpa阳性表达率为64.4%(47/73)。易损斑块内Hpa阳性表达率高于移形斑块，差异有统计学意义[92.9%(39/42)比25.8%(8/31)，χ2=34.968，P<0.01]。

2.3 不同形态颈动脉粥样硬化斑块内新生血管阳性表达率比较

免疫组织化学染色结果显示，颈动脉粥样硬化斑块内可见数个黄染血管内皮细胞(图4a)，阴性表达如图4b。易损斑块内新生血管阳性表达率高于移形斑块，差异有统计学意义[95.2%(40/42)比22.6%(7/31)，χ2=41.060，P<0.01]。

2.4 颈动脉粥样硬化斑块内Hpa与新生血管表达的组织学定位分析结果

对73个颈动脉粥样硬化斑块组织标本分别进行苏木素-伊红和免疫组织化学染色，结果显示，Hpa阳性表达主要位于颈动脉粥样硬化斑块的纤维帽及肩部(图5a，5b)，并且Hpa分布多的区域，新生血管分布也较多(图5c，5d)。

3 讨论

研究证实，动脉粥样硬化易损斑块可导致临床缺血和梗死事件[18]。关于动脉粥样硬化动物模型及冠状动脉粥样硬化性狭窄尸检的研究表明，Hpa与动脉粥样硬化斑块的产生和发展密切相关[13，19]。

硫酸乙酰肝素蛋白多糖是细胞外基质中重要的多聚糖成分[20]，其为内皮细胞的衍生产物，可抑制血管平滑肌细胞增殖、损伤后内膜新生反应，其由一个核心蛋白和数个与之共价连接的线性硫酸乙酰肝素侧链组成。Hpa能降解细胞外基质中硫酸乙酰肝素蛋白多糖，特异性识别硫酸乙酰肝素侧链上的特异性位点，将硫酸乙酰肝素裂解为10～20个糖单位大小的短糖链，并释放结合在硫酸乙酰肝素侧链上的生物活性分子进而发挥一系列病理生理作用[21-22]。

Hpa在正常组织中很少表达，主要限于胚胎、角蛋白细胞、血小板和活化的免疫细胞[23]。病理状态下，尤其在肿瘤细胞中Hpa的表达显著上调，其在肿瘤血管新生和转移中具有多重重要作用[23-24]，但其在动脉粥样硬化病变中的作用机制研究尚少[25-26]。

Baker等[19]对收集的猪冠状动脉粥样硬化斑块进行免疫组织化学染色分析，结果显示，动脉粥样硬化斑块从轻度病变发展为薄纤维帽易损斑块过程中，Hpa蛋白水平及其活性逐渐增加。Blich等[13]通过免疫组织化学染色方法检测尸解人体冠状动脉粥样硬化稳定斑块、易损斑块和正常对照动脉组中Hpa的表达，结果显示，动脉粥样硬化稳定斑块和正常对照动脉中的Hpa染色较弱，而动脉粥样硬化易损斑块内Hpa染色非常明显。本研究中，我们采用颈动脉内膜切除术患者的颈动脉粥样硬化斑块为研究标本，以尸解获得的正常动脉段作为对照，分析动脉粥样硬化斑块内Hpa的表达，免疫荧光染色结果显示，Hpa阳性表达率为64.4%(47/73)，在正常动脉段内未见Hpa表达；与移形斑块相比，易损斑块内Hpa阳性表达率更高[92.9%(39/42)比25.8%(8/31)，P<0.01]，与文献报道结果相符。

动脉粥样硬化斑块进展过程是从早期病理性内膜增厚逐渐发展至薄纤维帽易损斑块，该过程被认为是巨噬细胞浸润的结果[12]。早期动脉粥样硬化斑块纤维帽较厚，当由巨噬细胞释放的基质金属蛋白酶和平滑肌细胞出现凋亡时，纤维帽开始变薄，动脉粥样硬化斑块进而转变为易损斑块[27-29]，在该过程中炎性反应发挥了重要作用。本研究动脉粥样硬化斑块免疫组织化学染色结果显示，Hpa阳性棕色颗粒主要位于巨噬细胞细胞质内，可见随着炎性反应的进展Hpa表达增多[30]。

病理组织学研究表明，动脉粥样硬化斑块内病理性血管新生的存在和程度与斑块的破裂及临床脑血管事件相关，其在动脉粥样硬化易损斑块破裂的发生发展中起重要作用[4]。首先，病理性血管新生是在原有的毛细血管基础上，通过血管内皮细胞的分裂、增殖与迁移，从先前存在的血管处以芽生或套叠的方式扩展延伸形成新的毛细血管网[31]。血管新生过程中产生的幼稚血管极易破裂，进而导致斑块内出血，而动脉粥样硬化斑块内出血是导致其变为高危易损斑块的重要原因[32]。其次，斑块内幼稚血管可向斑块中心溢漏红细胞和炎性介质，而来自于红细胞膜的游离胆固醇堆积可潜在性增加斑块坏死中心的大小，并且触发加速斑块不稳定发展的事件链。同时，红细胞膜富含磷脂、游离胆固醇和游离血红蛋白，其均为活性氧的主要来源，可致氧化损伤进而引起坏死中心扩大和炎性细胞浸润。当斑块增大，随即出现缺氧及炎性细胞浸润，活化的T细胞、巨噬细胞和肥大细胞可产生前血管生成因子，如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素8，其均为斑块内病理性血管新生所需[30]。因此，随着斑块内病理性新生血管的增多，进一步可使斑块内出血风险增加，高危易损斑块形成，而致动脉粥样硬化斑块内不稳定事件链循环往复地发展。也有研究表明，Hpa促进血管新生的作用是通过降解内皮细胞下的基底膜和细胞外基质，促进内皮细胞的迁移，同时，释放与硫酸乙酰肝素结合的碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子，诱导血管生成，而被剪切的硫酸乙酰肝素片断又可促进碱性成纤维细胞生长因子与其受体结合发挥作用，诱导内皮细胞的增殖和迁移[33]。Hpa调节血管内皮生长因子基因的表达是通过激活Src家族所介导[34]，还可加强蛋白激酶B信号传导途径，激活邻近内皮细胞，为血管生成创造条件[35]。

在我们前期的研究中，采用超声造影技术在体观察颈动脉血管壁外膜滋养血管及动脉粥样硬化斑块内新生血管情况，发现症状性脑梗死组患者颈动脉粥样硬化斑块的肩部新生血管密度较高[5-7]。本研究苏木素-伊红和免疫组织化学染色结果均显示，新生血管主要位于动脉粥样硬化斑块的纤维帽及肩部，与我们前期的超声造影结果相符。本研究动脉粥样硬化斑块免疫组织化学双染色结果显示，斑块内Hpa阳性表达部位与血管新生部位具有共区域性，提示二者可能存在一定的相关性。可见，Hpa直接或间接作用于上述生长因子，从而参与血管新生过程。本研究中，易损斑块内新生血管阳性表达率高于移形斑块[95.2%(40/42)比22.6%(7/31)，P<0.01]，提示随着斑块内Hpa表达增多，血管新生增强，促使斑块从稳定向不稳定逐渐进展[36]。

综述所述，颈动脉粥样硬化斑块内可见Hpa阳性表达，且易损斑块内Hpa阳性表达率高于移形斑块，提示Hpa在动脉粥样硬化病变进展过程中具有一定的作用；颈动脉粥样硬化斑块内可见新生血管，且易损斑块新生血管表达高于移形斑块，提示血管新生参与动脉粥样硬化易损斑块形成的过程；动脉粥样硬化斑块内Hpa表达与新生血管具有共区域性，提示二者关系密切。本研究为单中心研究，样本量的积累有限，研究结果有待于大样本数据进行验证。由于动脉粥样硬化斑块形成和进展的具体作用机制非常复杂，Hpa的表达与动脉粥样硬化斑块内新生血管间相互作用、共同调节动脉粥样硬化斑块从稳定向不稳定进展的具体机制尚有待于进一步探讨。

志谢感谢首都医科大学三博脑科医院病理科齐雪玲医师、北京门头沟区医院神经内科朱倩倩医师、首都医科大学附属复兴医院高压氧科张文静医师的大力支持与帮助