槐耳清膏负性调节MMP-9表达抑制裸鼠胃癌淋巴结转移效果观察

汤加宁 谢华夏 张袁骕 徐志远 程向东

槐耳作为一种药用真菌，在我国已使用千年，随着科技的发展，其药用价值及抗肿瘤机制不断被我国学者发现。国内学者研究表明槐耳真菌的热水提取物槐耳清膏（主要活性物质为蛋白多糖）具有诱导胃癌、结肠癌、肺癌等数种癌细胞凋亡、抑制癌细胞生长及转移的作用[1-3]。本研究采用胃腺癌MKN-45细胞系构建裸鼠足垫胃癌移植瘤模型，予槐耳清膏灌胃治疗，观察足垫移植瘤的生长及腘窝淋巴结转移情况，通过检测和比较足垫胃癌组织基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的蛋白和mRNA表达情况，进而探讨槐耳清膏抑制胃癌MKN-45细胞淋巴结转移的机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和设备 FBS、RPMI 1640培养液均购自美国Gibco公司，RNA提取试剂盒（AllPrepDNA/RNA/Protein Mini Kit）购自德国QIAGEN公司，荧光定量试剂盒购自大连TaKaRa生物技术有限公司，逆转录试剂盒购自大连TaKaRa生物技术有限公司，qRT-PCR引物序列购自上海生工生物工程股份有限公司，抗体βactin购自武汉谷歌生物公司，抗体MMP-9购自美国Affinity公司，槐耳清膏购自启东盖天力药业有限公司。倒置相差显微镜购自德国LEICA公司，电泳仪、蛋白印迹检测系统均购自美国Bio-Rad公司，Real-time qPCR仪器购自美国Applied Biosystems公司。槐耳清膏灌注液的配制方法：将槐耳清膏溶解于0.9%氯化钠溶液中配成浓度为200mg/ml的灌洗液，经0.22μm微孔滤膜过滤后于4℃储存待用。

1.2 细胞和动物 人胃腺癌细胞株系MKN-45由南京凯基生物科技有限公司提供。40只4~6周龄雄性BALB/c裸鼠由浙江省中医药大学动物实验中心供应。

1.3 足垫胃癌移植瘤模型 将处于对数生长期的人胃腺癌细胞系MKN-45制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×107/ml。每只裸鼠右下肢足垫接种上述细胞悬液50μl，观察人胃腺癌MKN-45细胞在裸鼠足垫生长和成瘤情况。

1.4 给药及处理 建模成功后将裸鼠按体重配对法分成槐耳清膏组与氯化钠溶液组，每组20只。槐耳清膏组灌胃槐耳清膏液25ml/kg，2d 1次，氯化钠溶液组每只小鼠均灌胃氯化钠溶液0.5ml，2d 1次。灌胃给药前测量裸鼠体重。给药5周时再次测量体重后采用颈椎脱臼法处死两组裸鼠。

1.5 观察和检测指标

1.5.1 一般状态观察 建模成功后每日观察两组裸鼠活动度、进食和足垫肿瘤变化情况，每2d测量1次体重。

1.5.2 裸鼠足垫肿瘤相对体积（RTV）测算 在脱颈处死并解剖两组裸鼠后，参考公式RTV=πxyz/6（x为肿瘤长度，y为肿瘤宽度，z为肿瘤厚度），测算两组裸鼠足垫肿瘤的RTV。

1.5.3 裸鼠组织病理学分析 裸鼠处死后，解剖两组足垫肿瘤及相应腘窝淋巴结，固定于10%中性甲醛溶液中，石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察肿瘤组织及淋巴结转移情况，根据有腘窝淋巴结转移只数/建模成功只数计算腘窝淋巴结转移率。

1.5.4 MMP-9蛋白、mRNA表达检测 采用AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit试剂盒提取足垫胃癌组织总蛋白和总RNA。采用Western blot法检测两组裸鼠足垫胃癌组织MMP-9蛋白表达。以β-actin为内参，比较MMP-9蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。通过qRTPCR检测两组裸鼠足垫胃癌组织中的MMP-9 mRNA表达。使用紫外分光仪分析RNA纯度和浓度。根据cDNA反转录酶试剂盒说明书，逆转所有样品RNA，反应条件：42℃ 45min，70℃ 10min。将 cDNA 储存在-80℃超低温冰箱中备用。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，MMP-9的前引物序列为GCAATGCTGATGGGAAACCC，后引物序列为AGAAGCCGAAGAGCTTGTCC，β-actin的前引物序列为TCACCATGGATGATGATATCGC，后引物序列为 GACGGTTGGATCTGCCATGA。PCR反应条件：预变性95℃ 30s；PCR反应40个循环，95℃ 5s；60℃ 34s。反应结束后确认qRT-PCR的扩增曲线和熔解曲线。根据相对定量分析方法计算MMP-9mRNA在槐耳清膏组中相对于氯化钠溶液组中的扩增异倍数为2-ΔΔCt。其中Ct值表示目标扩增产物达到设定阈值时经历的循环数，ΔCt=Ct（MMP-9）-Ct（β-actin），ΔΔCt=ΔCt（槐耳清膏组）-ΔCt（氯化钠溶液组）。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组裸鼠一般状态比较 两组裸鼠在造模后及实验期间均未出现死亡，槐耳清膏组与氯化钠溶液组裸鼠在体重和食欲上比较无明显差别，槐耳清膏组裸鼠活跃度明显比氯化钠溶液组高。

2.2 两组裸鼠足垫肿瘤RTV 两组裸鼠足垫肿瘤为灰红色不规则圆形肿块，槐耳清膏组、氯化钠溶液组裸鼠足垫肿瘤 RTV 分别为（1611.85±611.83）mm3、（662.75±450.66）mm3，槐耳清膏组大于氯化钠溶液组，差异有统计学意义（t=3.80，P＜0.05）。

2.3 两组裸鼠腘窝淋巴结转移情况比较 槐耳清膏组裸鼠中有8只裸鼠出现腘窝淋巴结转移（40.0%）；氯化钠溶液组裸鼠中有15只出现腘窝淋巴结转移（75.0%）。槐耳清膏组转移率小于氯化钠溶液组转移率，差异有统计学意义（χ2=5.01，P＜0.05）。

2.4 两组裸鼠足垫胃癌组织MMP-9蛋白表达比较槐耳清膏组足垫胃癌组织MMP-9蛋白的表达水平低于氯化钠溶液组（图1）；氯化钠溶液组灰度值比（MMP-9/β-actin）为 0.97±0.01，槐耳清膏组为 0.74±0.05，差异有统计学意义（t=8.03，P＜0.05）。

2.5 两组裸鼠足垫胃癌组织MMP-9 mRNA表达比较槐耳清膏组足垫胃癌组织MMP-9 mRNA的ΔCt值为18.70±1.81，而氯化钠溶液组的为 15.31±1.10，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。且计算求得 2-ΔΔCt=0.095，故MMP-9 mRNA在槐耳清膏组的表达量为氯化钠溶液组的9.5%。

图1 两组裸鼠足垫胃癌组织MMP-9蛋白表达的电泳图

3 讨论

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症死亡的第4大主因[4]。肿瘤侵袭转移是严重影响患者预后的因素（其中淋巴结转移是胃癌转移的主要途径之一），因此如何抑制肿瘤转移是当今肿瘤治疗的热点。肿瘤的侵袭转移与多种信号通路及分子密切相关，其中MMP-9在肿瘤的侵袭转移之中起到重要的作用。MMP-9是基质金属蛋白酶家族的重要成员之一，可以降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、Ⅳ型胶原蛋白，从而破坏细胞间的天然屏障，降低细胞粘附力，增强其迁移能力，促进肿瘤细胞突破基底膜向外侵袭、转移[5]。国内外研究表明MMP-9与胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤侵袭转移的生物学行为高度相关[6-10]。Jonsson等[11]提出MMP-9可以作为生物标物来预测肿瘤患者的预后及复发。郑春雷等[12]研究表明胃癌患者的临床组织标本中MMP-9的表达与淋巴结转移、浸润程度和临床分期密切相关。笔者团队先前体外实验表明，槐耳清膏有阻滞细胞周期，抑制胃癌细胞增殖、诱导凋亡的作用[13]，另本团队前期通过动物实验证明槐耳清膏可调控PI3K/Akt信号传导通路降低MMP-9 mRNA表达抑制胃癌腹膜转移[1]。本研究是基于使用胃腺癌细胞系MKN-45构建裸鼠足垫胃癌移植瘤模型，并用槐耳清膏灌胃治疗，观察足垫肿瘤的生长及腘窝淋巴结转移情况，并检测和比较足垫肿瘤细胞中MMP-9的表达情况，进一步为槐耳清膏在体内的抗肿瘤机制提供实验依据。

在本实验研究中，构建足垫胃癌移植瘤模型成功率为100%，试验期间裸鼠均未出现死亡。槐耳清膏组裸鼠的足垫肿瘤RTV明显小于氯化钠溶液组，可见槐耳清膏能显著抑制MKN-45胃癌细胞的增殖生长，与本课题组前期体外实验结果一致[13]。槐耳清膏组裸鼠的腘窝淋巴结转移率明显低于氯化钠溶液组，从转移率上讲槐耳清膏具有抑制胃癌细胞MKN-45淋巴转移的作用。MMP-9具有降解ECM的作用，降低细胞黏附力，增强其迁移能力，与肿瘤细胞侵袭转移密切相关，为此本研究团队进一步检测了槐耳清膏组与氯化钠溶液组裸鼠足垫胃癌组织的MMP表达情况。通过对比，笔者发现槐耳清膏组裸鼠胃癌组织中MMP-9表达（mRNA水平及蛋白水平）均明显低于氯化钠溶液组。就此本研究团队认为槐耳清膏具有下调MMP-9表达的作用,这与本团队前期动物实验结果一致[1]。

综上所述，笔者认为槐耳清膏是一种潜在的抗肿瘤药物，对于胃癌的生长和淋巴转移具有一定的抑制作用，其抑制淋巴转移的机制可能是通过负性调节MMP-9的表达，进而抑制肿瘤ECM的降解，增加肿瘤细胞黏附能力，抑制肿瘤细胞向外侵袭转移。