长链非编码RNA AK001058对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

郑双 符竣惠 章孟 章灵敏 林峰

结直肠癌作为最常见的消化道恶性肿瘤之一，在世界范围内有着极高的病死率[1-2]。近年来，结肠癌外科手术、化疗药物以及小分子靶向药物治疗方面取得了很大进展[3]，早期结肠癌的治疗效果得到了一定程度的改善。因此，开发新的结直肠癌诊断方法，揭示结直肠癌的发病机制是结直肠癌基础研究领域现阶段的重点问题。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）通常指长度超过200nt的非编码RNA。LncRNA的碱基在长度和结构上与信使RNA（messenger RNA,mRNA）非常类似，但由于缺少开放阅读框（open reading frame,ORF）而不能被编码翻译成蛋白。越来越多的研究表明，lncRNA非但不是在生物进化过程中的基因冗余，而且在个体发育和癌症等疾病的发展过程中发挥了重要的作用[4]。因此，以lncRNA作为新的肿瘤标志物及抗肿瘤药物靶点的研究成为最近肿瘤生物学领域的热点问题。AK001058是最近发现的与癌症相关的lncRNA，其在胃癌、结肠癌组织中表达上调[5-6]，但在肿瘤发生（尤其是结肠癌）中的作用还缺少深入的研究。在本文中，笔者研究lncRNA AK001058在结肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2017年7月至2018年10月本院3例结肠癌手术患者（TNM分期Ⅱ~Ⅲ级，未发生远处转移）的结肠癌组织和癌旁正常组织（距离肿瘤边缘≥5cm）。人结肠癌细胞系SW480购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；FBS（500ml，批号：10099-141）和 DMEM 培养基（500ml，批号：11965-092）、消化细胞所用的 PBS（500ml，批号：14190-144）和 0.25%胰蛋白酶（500ml，批号：25200072）、转染细胞所用的 Opti-MEM 培养基（500ml，批号：31985062）和 Lipofectamine RNAiMAX（0.75ml，批号：13778150）转染试剂均购自美国ThermoFisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染 根据转染试剂说明书，转染前1d将细胞接种于12孔板中，直到细胞融合度达到60%~80%时进行转染。在准备好的2管Opti-MEM中分别加入1μl siRNA和 1μl Lipofectamine RNAiMAX，然后将稀释的混合液于室温静置5min，采用悬滴法将其加入细胞，48h后进行检测。根据AK001058核苷酸序列设计了两条siRNAs即siRNA-1和siRNA-2，并使用靶向荧光素酶（luciferase）的siRNA作为对照siRNA，其引物序列信息见表1。

表1 siRNAs序列

1.2.2 癌组织和SW480细胞AK001058的表达 采用Trizol法提取组织或细胞总RNA，测定浓度之后将其反转录为 cDNA，然后利用 SYBR Premix Ex Tag（Takara）在ABI 7500仪器上进行实时定量荧光PCR检测，反应程序设为 95℃预变性 5min，95℃变性 15s、65℃退火 15s、72℃延伸30s共35个循环。AK001058及内参基因U6引物见表2。

表2 荧光定量PCR引物序列

1.2.3 细胞增殖活性检测 将消化好的细胞制成浓度为1×106/ml的细胞悬液，取100μl加入96孔板中，每个样品设置5个复孔。细胞培养24h待细胞贴壁后，转染对照 siRNA 和 siRNA-1、siRNA-2，并在转染 0、24、48、72和96h 5个时点加入含CCK-8的培养基（约占原培养基体积的10%），37℃孵育4h，待颜色变橙色后拿出来放置在酶标仪上进行检测。

1.2.4细胞凋亡率检测 采用Annexin V/PI双染法。转染对照siRNA、siRNA-1和siRNA-2的SW480细胞培养48h后，使用0.25%Tripsin/EDTA消化细胞，并收集细胞用PBS重悬，调整细胞密度为1×106/ml。然后取500μl样品加入 5μl Annexin V-FITC 和 5μl碘化丙啶（PI），轻轻混匀后室温避光孵育10min，随后使用流式细胞仪进行检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织和癌旁组织中AK001058表达水平的比较 与癌旁组织中AK001058的表达水平（1.00±0.12）相比，结肠癌组织中的（2.58±0.37）明显上调，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 对照siRNA、siRNA-1和siRNA-2 AK001058表达水平的比较 与对照siRNA的细胞中AK001058的表达水平（1.00±0.00）相比，siRNA-1（0.62±0.09）和 siRNA-2（0.54±0.05）的均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 对照siRNA、siRNA-1和siRNA-2的SW480细胞增殖活性比较 与对照siRNA的细胞相比，在转染后24、48h，siRNA-1和siRNA-2的细胞增殖活性相对较低，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）；而随着细胞培养时间的延长，在转染72、96h，siRNA-1和siRNA-2的细胞增殖活性均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 3。

表3 对照siRNA、siRNA-1和siRNA-2的SW480细胞增殖活性比较

2.4 对照siRNA、siRNA-2和siRNA-2的SW480细胞凋亡率的比较与对照siRNA的细胞凋亡率[（2.60±0.72）%]相比，转染siRNA-1[（6.81±2.01）%]和siRNA-2[（9.23±2.53）%]的均上升，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

3 讨论

开发新的肿瘤标志物和药物靶点是当前结肠癌基础研究领域的热点问题。近年来，lncRNA在肿瘤发生中的作用受到越来越多的关注。在结肠癌的研究中，已经发现了一系列具有重要作用的lncRNA会在肿瘤发生过程中出现异常表达，有些（如 CCAT1[7]、CCAT2[8]、MYLKP1[9]等）在结肠癌组织中表达上调，表现出原癌基因的特性，促进癌细胞的增殖和转移，而有些则在癌组织中呈现低表达，发挥抑癌基因的作用[4]。Niu等[6]发现了AK001058在人结肠癌组织中表达水平上调，但其在肿瘤发生中的作用却没有进行深入的研究。在本研究中，笔者同样使用结肠癌病理组织样品，采用实时定量荧光PCR法验证了AK001058在结肠癌组织中的表达水平，结果显示AK001058在结肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，该结果提示AK001058可能在结肠癌发生、发展过程中具有重要的生理意义。进一步以结肠癌细胞系SW480为研究对象，发现下调AK001058的表达会抑制结肠癌细胞的增殖并促进细胞走向凋亡。这些结果表明在结肠癌肿瘤发生的过程中，AK001058发挥了促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用。

lncRNA并不具有转录活性，却可以通过与特定的蛋白、DNA或RNA结合，调控靶基因的转录活性或者作为骨架联系多种蛋白形成核糖核蛋白复合体，从而实现对细胞生理功能的调控[10]。已有的研究表明，在肿瘤发生过程中，lncRNA可以直接参与基因转录调控肿瘤相关基因的表达，如DNA损伤活化P21相关非编码RNA（P21 associated ncRNA DNA damage activated，PANDA）可以与转录因子NF-YA结合从而抑制DNA损伤引起的细胞凋亡[11]。而在肝癌中，过表达PANDA也促进了癌细胞的增殖[12]。lncRNA还可以在转录后水平调控基因的表达，如基因间长非编码RNA-RoR（Linc-RoR）可以与核不均一核糖核蛋白（hnRNP）及AU富集元件RNA结合蛋白1（AUF1）相互作用，影响癌基因c-myc mRNA的稳定性[13]。此外，越来越多的研究也发现了lncRNA参与了诸如 p53[14]、NF-κB[15-16]、PI3K/AKT[17]及 Notch[18]等多条肿瘤相关的信号通路的调控作用，表明lncRNA可以多维度参与肿瘤发生的调控。

本研究结果提示了lncRNA AK001058对结肠癌细胞增殖和凋亡的调控作用，但未深入研究其调控的下游基因以及信号通路，因此AK001058在结肠癌细胞中具体作用的分子机制还有待进一步探究。