海鲜菇多糖乙酰化修饰工艺及其抗氧化活性

张春洁，赵圆圆，陆婷婷，赵 文，苏乐乐，徐 兵，陈义勇，关彦明

（1. 常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500；2. 中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015）

海鲜菇（Hypsizygus marmoreus）隶属担子菌门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、玉蕈属，又名蟹味菇、真姬菇，富含蛋白质、维生素、多糖、微量元素等多种营养素［1］. 多糖是海鲜菇的主要成分之一，目前对海鲜菇多糖（Polysaccharides fromhypsizygus marmoreus，HMP）的研究主要集中在生物活性如抗肿瘤、提高免疫力［2］、抗病毒［3］、抗氧化［4］、分子结构特性［4］及提取［5-8］等方面，而对HMP化学结构修饰的研究还未见报道. 随着对多糖结构的深入研究，发现用适当的手段对多糖进行结构上的化学修饰，对多糖生物活性有较大的影响［9］.

本研究采用乙酰化方法对HMP结构进行修饰，利用响应面法对HMP乙酰化修饰工艺进行优化，并探讨乙酰化海鲜菇多糖（Acetylated polysaccharides fromhypsizygus marmoreus，Ac-HMP）的抗氧化活性，旨在为HMP乙酰化修饰并开发一种新型天然功能食品添加剂提供参考.

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

海鲜菇（昆山正兴食用菌有限公司提供）；DPPH（深圳欣博盛生物科技有限公司） ；Tris（苏州亚科科技股份有限公司）； 乙酸酐、过氧化氢、水杨酸等试剂均为分析纯.

1.2 主要仪器与设备

HH-2智能数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；小型高速粉碎机（山东维诺医药设备制造有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（北京成萌伟业科技有限公司）；SHB-B95循环水式多用真空泵（郑州世纪双科实验仪器有限公司）；DF-101S恒温加热磁力搅拌器（金坛市友联仪器研究所）；722型数显可见分光光度计（上海光学仪器五厂有限公司）；IRTracer-100傅里叶变换红外光谱仪（日本岛津公司）；CR22GⅡ高速冷冻离心机（日本HITACHI公司）； Alpha 1-2 LD plus真空冷冻干燥机（德国CHRIST公司）.

1.3 实验方法

1.3.1 HMP的制备

海鲜菇经过干燥（30 ℃，24 h）粉碎，将海鲜菇粉末（100 g）与蒸馏水（4 000 mL）混合，80 ℃条件下浸提8 h，然后将提取液离心（4 500 r/min，20 min）. 弃去沉淀，将上清液旋蒸浓缩至原来体积的1/4，用Sevage法［10］除去蛋白，然后加入4倍体积95%乙醇，4 °C条件下醇沉24 h后再离心，将沉淀冷冻干燥得到HMP.

1.3.2 Ac-HMP的制备［11］

称取HMP 100 mg，用10 mL蒸馏水充分溶解，用NaOH溶液（5 mol/L）将其pH调至9.0. 向HMP溶液中加入一定体积的乙酸酐，搅拌均匀并充分反应，反应结束后用HCl调节pH至7.0，将反应液转入截留分子量为15 000 Da的透析袋中，用蒸馏水透析48 h，透析完成后将反应液旋蒸浓缩至原来体积的1/4，然后加入4倍体积的95%乙醇沉淀24 h，沉淀经过真空冷冻干燥后得到Ac-HMP.

1.3.3 乙酰化取代度（Degree of substitution，DS）的测定［12］

取100 mg Ac-HMP，用10 mL 0.01 mol/L NaOH溶液充分溶解，加入两滴酚酞指示剂，并用0. 01 mol/L HCl溶液滴定至红色褪去，记录所消耗盐酸的体积，根据以下公式计算取代度.

乙酰基含量=［（NaOH溶液体积×NaOH溶液浓度-消耗HCl溶液体积×HCl溶液浓度）×0.043］/样品质量×100%

取代度（DS）=（132×乙酰基含量）/（4 300-42×乙酰基含量）

1.3.4 单因素实验

1.3.4.1 反应时间对Ac-HMP取代度的影响

取100 mg HMP，用10 mL蒸馏水充分溶解，用5 mol/L NaOH调节pH至9.0，加入2.5 mL乙酸酐，反应温度50 ℃，研究反应时间（1，2，3，4，5 h）对Ac-HMP取代度的影响来确定适宜的反应时间.

1.3.4.2 反应温度对Ac-HMP取代度的影响

取100 mg HMP，用10 mL蒸馏水充分溶解，用5 mol/L NaOH调节pH至9.0，加入2.5 mL乙酸酐，反应时间3 h，研究反应温度（40，50，60，70，80 ℃）对Ac-HMP取代度的影响来确定适宜的反应温度.

1.3.4.3 乙酸酐用量对Ac-HMP取代度的影响

取100 mg HMP，用10 mL蒸馏水充分溶解，用5 mol/L NaOH调节pH至9.0，反应温度50 ℃，反应时间3 h，研究乙酸酐用量（1.5，2，2.5，3，3.5 mL）对Ac-HMP取代度的影响来确定适宜的乙酸酐用量.

1.3.5 响应面分析实验设计

在单因素实验基础上，以乙酰化取代度为指标，选择反应时间、反应温度、乙酸酐用量3个因素，通过三因素三水平的响应面分析法确定HMP乙酰化修饰的最佳工艺.

1.3.6 HMP与Ac-HMP的红外光谱表征

分别取1 mg经过干燥的HMP和Ac-HMP，加入2 mg溴化钾混匀，压片，进行红外光谱扫描，波数范围为400～4 000 cm-1.

1.3.7 抗氧化活性

1.3.7.1 HMP与Ac-HMP对羟自由基清除作用［13］

依次加入1.0 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，1.0 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，然后分别加入不同浓度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）的HMP和Ac-HMP溶液1.0 mL，最后加入9 mmol/L H2O2溶液1.0 mL，混合均匀后37 ℃下反应30 min，测定OD510值，记为Ai. 用蒸馏水替代过氧化氢重复上述操作，测定的OD510值计为Aj. 用蒸馏水替代HMP和Ac-HMP溶液重复上述操作，测定的OD510值计为A0，测定3次，根据以下公式计算羟自由基的清除率.

1.3.7.2 HMP与Ac-HMP对超氧阴离子自由基清除作用［14］

分别加入HMP和Ac-HMP溶液（浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）1.0 mL，Tris-HCl缓冲液（50 mmol /L）4.5 mL和3.2 mL蒸馏水，混合均匀后，25 ℃条件下恒温水浴20 min，然后分别加入3 mmol/L的邻苯三酚0.3 mL，恒温（25 ℃）水浴3 min. 待反应结束后，立即滴加HCl溶液（10 mol/L）终止反应. 测定OD325值，记为A；空白实验组用蒸馏水替代多糖溶液重复上述操作，测定OD325值，记为A0. 测定3次，根据以下公式计算超氧阴离子自由基的清除率.

1.3.7.3 HMP与Ac-HMP对DPPH自由基清除能力的测定［15］

分别加入HMP和Ac-HMP溶液（浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）2.0 mL，然后分别加入DPPH溶液（无水乙醇配制，浓度为0.1 mmol/L）2.0 mL，室温条件下避光反应30 min，测定OD517值，记为A2. 分别以蒸馏水代替DPPH溶液、多糖溶液测定OD517值，分别记为A1和A0，测定3次，根据以下公式计算DPPH自由基的清除率.

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 反应时间对Ac-HMP取代度的影响

反应时间对Ac-HMP取代度的影响如图1所示. 从图1可以看出，在1～3 h时间范围内，取代度随着时间的延长而提高，在3 h之后取代度随着时间的延长而下降，因此确定合适的反应时间为3 h.

2.1.2 反应温度对Ac-HMP取代度的影响

反应温度对Ac-HMP取代度的影响如图2所示. 从图2可以看出，随着温度的提高，取代度逐步增加然后呈下降趋势，当温度达到40 ℃时，取代度达到最大值，因此适宜的反应温度为40 ℃.

2.1.3 乙酸酐用量对Ac-HMP取代度的影响

乙酸酐用量对Ac-HMP取代度的影响如图3所示. 从图3可以看出，取代度随着乙酸酐用量增加而提高，当乙酸酐用量在3 mL时，取代度达到最大，因此适宜的乙酸酐用量为3 mL.

图1 反应时间对Ac-HMP取代度的影响

图2 反应温度对Ac-HMP取代度的影响

2.2 HMP乙酰化修饰工艺优化

2.2.1 响应模型的建立与分析

在单因素实验基础上，以取代度为指标，反应时间（A）、反应温度（B）、乙酸酐用量（C）3个实验因素和水平设计见表1，结果见表2，方差分析见表3.

借助Design-Expert软件进行二次响应面回归分析，得到如下多元二次响应面回归模型：

由表3回归分析结果可得，模型的F值为14.12，P＜0.01，表明该模型差异极显著，可以用于实际实验. 失拟项P=0.087 1（＞0.05），说明失拟不显著，实验过程中未知因素对本实验结果影响较小，模型选择正确.R2为0.947 8，表明取代度的实际值与模型的预测值有较好的拟合度.

2.2.2 响应面图分析

两因素交互作用对Ac-HMP取代度的影响如图4所示. 从图4可以看出，温度对Ac-HMP取代度影响明显，乙酸酐用量的影响次之，反应温度的影响最不显著. 时间和乙酸酐用量对Ac-HMP取代度交互作用显著，温度与乙酸酐用量对Ac-HMP取代度交互作用相对弱一些，而反应温度和反应时间对Ac-HMP取代度交互作用不明显.

2.2.3 HMP乙酰化修饰最佳工艺确定及验证

通过借助Design-Expert 软件对响应面设计实验结果进行分析，得到HMP乙酰化修饰的最优工艺条件为：时间3.85 h，温度59.86 ℃，乙酸酐用量为2.88 mL. 在该优化条件下，海鲜菇多糖乙酰化取代度可达到0.602.

为了判断优化工艺参数预测结果的可靠性，在具体实验中将最优工艺条件进行适调整为反应时间4 h，反应温度60 ℃，乙酸酐用量为3 mL. 在调整条件下，测定Ac-HMP的取代度为0.59，与预测取代度接近，从而验证了该模型具有可行性.

2.3 HMP与Ac-HMP的红外光谱分析

HMP与Ac-HMP的红外光谱图如图5所示. 从图5可以看出，HMP和Ac-HMP均有多糖类物质红外特征峰：在波数3 427 cm-1左右处出现的宽吸收峰主要是多糖中的-OH基团引起的；3 132.27 cm-1处出现的弱吸收峰是C-H伸缩振动引起的；Ac-HMP在波数1 724.13 cm-1处出现的弱吸收峰主要是由酯基C=O基团的伸缩振动引起的；1 247.78 cm-1处出现弱的酯基C-O基团伸缩振动峰，该振动峰和乙酰基相关，表明存在乙酰基［16］. 由此可知在HMP中成功加上了乙酰基团，即乙酰化修饰成功.

图3 乙酸酐用量对Ac-HMP取代度的影响

表1 实验因素与水平

表2 响应面分析结果

表3 回归模型方差分析

图4 两因素交互作用对Ac-HMP取代度的影响

2.4 抗氧化活性

2.4.1 HMP与Ac-HMP对羟自由基清除作用

HMP与Ac-HMP对羟自由基清除作用见图6. 从图6可以看出，在实验浓度范围内，HMP和Ac-HMP对羟自由基具有较强的清除作用，随着浓度的增加不断上升，呈浓度依赖关系. 与HMP相比，Ac-HMP对羟自由基清除作用显著增强. 可能是因为多糖加入乙酰基后，导致多糖支链充分展开，水溶性增加进而有助于抗氧化活性的发挥［17］. 梁少茹等人［11］研究发现与未修饰的茶多糖相比，乙酰化修饰后的茶多糖对羟自由基的清除作用明显增强. 宋逍等人［18］研究发现乙酰化修饰后的金银花多糖清除羟基自由基的能力增强. 但是不是所有的多糖经过改性后生物活性都会提高. 研究发现蛹虫草多糖［19］、松树蕈多糖［20］经过乙酰化修饰后抗氧化活性反而降低，这可能是多糖种类及结构不同造成抗氧化活性的差异［20］.

2.4.2 HMP与Ac-HMP对DPPH自由基清除作用

HMP与Ac-HMP对DPPH自由基清除作用见图7. 从图7可以看出，在选择的实验质量浓度范围内，HMP与Ac-HMP对DPPH自由基均有一定的清除能力，且清除能力与浓度呈正相关. 与HMP相比，Ac-HMP对DPPH自由基清除能力增强，这可能与乙酰化后导致更多多糖内部的羟基或羧基暴露，使多糖水溶性增加有助于活性发挥有关［21］.

2.4.3 HMP与Ac-HMP对超氧阴离子自由基清除作用

图5 HMP和Ac-HMP红外光谱图

HMP与Ac-HMP对超氧阴离子自由基清除作用见图8. 从图8可以看出，在实验浓度范围内，随着浓度的升高，HMP和Ac-HMP对超氧阴离子自由基清除能力逐步提高. 与HMP相比，Ac-HMP对超氧阴离子自由基清除能力有一定程度的增强，这可能是因为HMP经过修饰后导致Ac-HMP空间结构变化，具体机理有待深入研究. 已有研究也表明黑木耳多糖［22］、二色补血草多糖［23］经过乙酰化修饰后对超氧阴离子自由基的清除能力有所增强.

图6 HMP和Ac-HMP对羟自由基清除作用

图7 HMP和Ac-HMP对DPPH自由基清除作用

图8 HMP与Ac-HMP对超氧阴离子自由基清除作用

3 结论

以海鲜菇为原料，采用热水浸提法提取HMP，采用乙酸酐法制备Ac-HMP，采用响应面法对HMP乙酰化修饰工艺进行优化，并探讨了HMP与Ac-HMP的抗氧化活性. HMP乙酰化最佳工艺条件为：时间3.85 h，温度59.86 ℃，乙酸酐用量2.88 mL. 在该优化条件下，HMP乙酰化取代度达到0.602. 与HMP相比，Ac-HMP抗氧化活性明显增强.

该研究通过对HMP乙酰化修饰，进而改变HMP分子结构，提高了HMP的抗氧化活性，说明乙酰化修饰是一种较为理想的HMP结构改性方法. 这对进一步揭示多糖构效关系及HMP在未来开发一种新型天然功能食品添加剂具有重要意义，但是对影响Ac--HMP抗氧化活性的结构因素如乙酰基取代位置、空间构象及取代度大小等尚不清楚，仍需进一步研究.