西北地区4种优质饲草的肉牛体外瘤胃发酵性能研究

张霞,李妙善,周恩光,王虎成

(兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室，兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020)

近年来，我国反刍家畜养殖业发展迅速，40%～80%的粗饲料被用于反刍动物饲粮中，提供给宿主动物和瘤胃微生物重要的营养物质[1-2]， 其次，苜蓿(Medicagosativa)、燕麦(Avenasativa)、饲用玉米(Zeamays)等优质饲草是我国建植栽培草地、也是黄土高原丘陵沟壑区进行饲草生产的主要资源，亦是反刍动物养殖的主要粗饲料；同时，充分利用优质饲草(玉米、燕麦、苜蓿青贮等)作为饲草资源，将有助于缓解草畜矛盾、充分利用非常规饲草资源，利用不同饲草的组合来改善进入反刍动物体内的营养平衡，加强我国特别是西北地区饲草资源合理利用，促进畜牧业的高效发展。然而，优质粗饲料相对而言存在较大的缺口。因此，如何更好地利用与提高研究区优质粗饲料的利用率被广泛关注。目前评定饲料营养价值的主要方法包括体内法、半体内法和体外法，其体外瘤胃发酵法因其方法简便、经济、快速而被广泛用于评定饲料的营养价值[3-5]。据报道，韩肖敏等[6]用体外产气法评价玉米秸秆、稻草(Oryzasativa)、玉米秸秆青贮与精料的组合效应，结果表明60%玉米秸秆+40%稻草、24%玉米秸秆+16%稻草+60%玉米秸秆青贮、9.6%玉米秸秆+6.4%稻草+24%玉米秸秆青贮+60%精料为最优组合；张建勋等[7]研究饲粮精粗比对南江黄羊瘤胃体外发酵的影响结果表明高精料饲粮对南江黄羊体外发酵有显著的影响；孙国强等[8]利用体外瘤胃发酵法研究全株玉米青贮与花生蔓(Arachishypogaea)和羊草(Leymuschinensis)间的组合效应，结果表明全株玉米青贮与花生蔓比例为70: 30的组合、全株玉米青贮-花生蔓-羊草比例为56∶24∶20的组合具有最大组合效应；张吉鹍等[9]对稻草与多水平苜蓿混合瘤胃体外发酵组合效应的整体研究，结果表明稻草与苜蓿适宜添补量为40%～60%；李妍等[10]对体外法评价玉米秸秆、谷草和玉米秸秆青贮饲料组合效应的研究，结果表明玉米秸秆和谷草的搭配比例为60∶40，玉米秸秆、谷草、玉米秸秆青贮饲料的搭配比例为12∶8∶80为最优组合；孟梅娟等[11]对小麦(Triticumaestivum)秸秆与米糠粕瘤胃体外发酵组合效应研究表明小麦秸秆与米糠粕的最优组合是75∶25；并且对相关氮源水平、半胱胺、植物精油、沙柳(Salixcheilophila)、苎麻(Boehmerianivea)等的体外瘤胃发酵特性和饲用价值研究报道较多[12-16]；综合以上研究进展，前人研究主要集中在利用体外瘤胃发酵法对秸秆、稻草、谷草、羊草类等粗饲料，不同精粗比以及一些添加剂的研究、开发和利用。但以玉米、燕麦、苜蓿裹包青贮及苜蓿干草这4种优质粗饲料饲用价值和适宜配合比例尚未见系统研究报道。为此，本研究选用黄土高原丘陵沟壑区推广应用的玉米、燕麦、苜蓿裹包青贮及苜蓿干草为试验材料，利用体外产气法评价单一饲草及不同组合的肉牛瘤胃发酵性能及组合效应，旨在为该研究区几种优质饲草的饲用价值及合理搭配做初步探究，为正确进行肉牛日粮中粗饲料搭配积累数据和提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用饲草为玉米、苜蓿、燕麦裹包青贮，均购自甘肃民祥牧草有限公司，苜蓿干草以及供体动物饲用精料均有由养殖场提供，采集的鲜样经冻干机冻干制成粉样，干草直接制成粉样，备作常规化学成分分析与体外产气试验，饲草营养成分如表1所示。

表1 饲草营养成分Table 1 Nutrients of 4 kinds of forage (干物质基础dry matter basis, %)

1.2 试验设计

采用单因子重复试验设计，将4种优质饲草按干物质组成7种不同比例组合：组合1(50%玉米青贮+50%燕麦青贮，C1)、组合2(50%玉米青贮+50%苜蓿青贮，C2)、组合3(80%玉米青贮+20%苜蓿干草，C3)、组合4(50%燕麦青贮+50%苜蓿干草，C4)、组合5(70%玉米青贮+10%燕麦青贮+20%苜蓿青贮，C5)、组合6(65%玉米青贮+15%燕麦青贮+25%苜蓿青贮，C6)、组合7(50%玉米青贮+20%燕麦青贮+30%苜蓿青贮，C7)，共构成11种发酵底物。

1.3 试验用瘤胃液供体动物

试验于2017年9月在甘肃省定西市甲天下肉牛养殖场进行。选取3头健康状况良好，体重约600 kg的西门塔尔牛作为瘤胃液供体动物。试验期间肉牛拴系饲养，保持圈内清洁干燥，定期进行消毒。全混合饲粮(total mixed rations, TMR)日饲喂2次(早上7:30和下午16:00)，采食后自由饮水。

1.4 体外发酵

体外发酵试验参照Menke等[17]推荐的方法进行。在晨饲前，用瘤胃液采集器(科立博A1164K)经口腔采集3只肉牛的瘤胃液共1 L，迅速装入充满CO2的密闭容器并保温39 ℃尽快带回实验室。把取得的瘤胃液经4层纱布过滤，得到滤液，并与人工唾液以体积比1∶2混合，39 ℃恒温，同时通入无氧CO2，得到人工瘤胃液。然后将其置于39 ℃磁力搅拌器上不断搅拌，同时通入CO2气泡(需通入底部)，直至溶液颜色变为无色，呈还原状态，在液面以上持续通入CO2确保厌氧。准确称量试验饲料0.4000 g于已装入10 g左右玻璃珠的尼龙袋(0.048 mm)中，封口后置入100 mL刻度玻璃注射器中；将40 mL混合液迅速注入装样注射器,密封、排气后于(39.0±0.5) ℃水浴摇床连续培养48 h，每个样3个重复；同一批次设定3个空白对照。

1.5 测定指标及方法

1.5.1产气量及产气动力学 分别在培养3、6、9、12、24、36、48 h记录每个注射器活塞的位置并读数，以计算各时间点的产气量(gas production, GP)。计算公式为：

某时间点的GP=该段时间样品GP-该段时间空白样GP

根据Ørskov等[18]的产气模型，将各种样品在3、6、9、12、24、36、48 h时的产气量代入下列公式计算各部分产气量。

GP=a+b(l-exp-ct)

式中：GP，t时间的产气量(mL·g-1)；a，快速降解部分产气(mL·g-1)；b，慢速降解部分产气量(mL·g-1)；c，产气速率(%·h-1)；a+b，潜在产气量(mL·g-1)。

1.5.2干物质消失率(dry matter disappearance, DMD) 在体外48 h发酵结束后，迅速放置冷水中终止发酵,将已编号并称重的尼龙布用蒸馏水冲洗数次直至干净，然后将尼龙布小心无损的转移到烘箱中以105 ℃烘24 h至恒重，计算干物质消失率。

饲料干物质消失率=[样本干物质量-消化后残渣干物质量]×100%/样本干物质量

1.5.3体外发酵参数 培养48 h后，用SX-620型酸度计测定培养液pH值；采用苯酚-次氯酸钠显色法测定氨态氮(NH3-N)浓度，具体程序参照周建伟[19]的方法；挥发性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)浓度参照李晓亚[20]的方法，使用Agilent-6890A型气相色谱仪测定。

1.5.4组合效应指数的计算 参照王旭[21]所使用的方法计算指标的单项组合效应指数(single factors associative effects index, SFAEI)与多项组合效应指数(multiply factors associative effects index, MFAEI)，具体公式如下：

SFAEI=(组合后实测值-加权估算值)/加权估算值
MFAEI=∑单项组合效应值

式中：加权估算值=某种饲料的实际测定值×所占比例+另一种饲料的实际测定值×所占比例。

1.6 数据分析

数据经Excel 2010初步处理后，使用SPSS 20.0软件的一般线性模型进行方差分析，分别对4种单一原料和7种组合饲料进行Duncan氏多重比较；用非线性回归参数估计程序求出产气动力学参数；结果用“平均值±标准误”表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 优质饲草的肉牛瘤胃体外发酵产气性能

随培养时间的延长，各组产气量逐渐上升，其中发酵初期增长速度较快(表2)。4种单一饲料在各时间点的GP玉米青贮最高，苜蓿青贮最低(P<0.05)，其中48 h的GP，玉米青贮比其他3种分别提高了29.15%(燕麦青贮)、66.17%(苜蓿青贮)和38.04%(苜蓿干草)。7种组合在各时间点产气特点为，C3的GP最高，C4最低(P<0.05)，其中C3比其他各组合分别提高了24.07%(C1)、30.12%(C2)、39.08%(C4)、12.81%(C5)、22.57%(C6)和25.52%(C7)，且其他各组合间亦存在显著差异(P<0.05)。

4种单一饲料的慢速降解部分产气量和潜在产气量依玉米青贮、燕麦青贮、苜蓿青贮、苜蓿干草的次序降低，且存在显著差异(P<0.05)(表3)；快速降解部分产气量和产气速率常数分别为玉米青贮(-9.47 mL·g-1)和苜蓿干草(0.04%·h-1)最高，与其他单一饲料存在显著性差异(P<0.05)。7种组合中的快速降解部分产气量和产气速率常数均以C2最高，分别为-17.56 mL·g-1和0.07 %·h-1；慢速降解部分产气量和潜在产气量均以C3最高，分别为167.69和165.00 mL·g-1，均显著高于其他组合(P<0.05)。

2.2 优质饲草在肉牛体外瘤胃发酵48 h的DMD与发酵参数

体外发酵48 h后，4种单一饲料中玉米青贮的干物质消失率(DMD)最高(81.73%)，显著高于其他3种粗饲料(P<0.05)；培养液的pH介于6.27～6.72，苜蓿青贮pH最高，且各组间差异显著(P<0.05)；NH3-N浓度，燕麦青贮(38.12 mg·dL-1)显著高于其他3种粗饲料(P<0.05)。7种组合的DMD以C2显著低于C5和C7(P<0.05)；pH介于6.40～6.69，其中C3显著低于其他6种(P<0.05)，其中C5和C6最高；NH3-N的浓度C1与C2显著高于其他5种，其中C7最低(表4)。

表2 优质饲草的肉牛体外瘤胃发酵产气量Table 2 In vitro gas production of high-quality forage treated with rumen fluid of beef cattle (mL·g-1)

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，下同。

Note: Different small letters in the same column indicate significant difference between the treatments(P<0.05), while same letter in the same column indicate not significant difference between the treatments (P>0.05), the same below.

表3 优质饲草的肉牛体外瘤胃发酵产气动力学参数Table 3 In vitro gas production kinetic parameters of high-quality forage treated with rumen fluid of beef cattle

注：“-”表示产气滞后，快速降解部分产气量大小由绝对值确定。

Note: “-” indicates gas production lag, and partial gas production of rapid degradation is determined by absolute value.

表4 优质饲草在肉牛体外瘤胃发酵48 h的DMD、pH及NH3-N 浓度Table 4 The pH and NH3-N concentration of fermentation fluid and DMD of high-quality forage treated 48 h in vitro with rumen fluid of beef cattle

4种单一粗饲料培养48 h后培养液的总挥发性脂肪酸(TVFA)和丁酸浓度均为玉米青贮显著高于苜蓿青贮和干草(P<0.05)；丙酸浓度玉米青贮显著高于其他3种，且燕麦青贮显著高于苜蓿青贮和干草(P<0.05)；乙酸/丙酸(acetic acid/propionic acid, A/P)玉米青贮和燕麦青贮显著低于其他2种(P<0.05)(表5)。7种组合培养48 h后，培养液的TVFA浓度C2和C4显著低于C5和C6(P<0.05)；乙酸含量C1显著低于C2、C4和C7(P<0.05)，且C7最高；丙酸含量C1、C5、C6显著高于C2、C4、C7(P<0.05)；A/P 值C7显著高于C1、C3、C5、C6(P<0.05)，且C1最低；丁酸含量C5显著高于C2、C3、C4、C7(P<0.05)，且C7最低；戊酸含量C7显著低于其他6组(P<0.05)，且C4最高。

表5 优质饲草在肉牛体外瘤胃发酵48 h的总挥发性脂肪酸构成Table 5 The volatile fatty acid profile of fermentation fluid of high-quality forage treated 48 h in vitro with rumen fluid of beef cattle

2.3 优质饲草的肉牛体外瘤胃发酵48 h的组合效应

GP和乙酸含量只有C1出现负组合效应，其他6种组合均为正组合效应；DMD在C1、C2和C3均为负组合效应，其余4组均为正组合效应，且C4最大(0.2330)；pH在C2和C3时为负组合效应，其余组合间均为正组合效应；NH3-N浓度在各组合均出现负组合效应；丙酸与丁酸含量在各组合均为正组合效应，且均在C4时达到最大，分别为0.4892和0.6008(表6)。所有组合的综合组合效应均为正效应，由高到低依次为C4、C2、C5、C1、C3、C6、C7。故而，本试验条件下，C4为最佳组合(50%燕麦青贮+50%苜蓿干草)，C2(50%玉米青贮+50%苜蓿青贮)次之，且玉米青贮、燕麦青贮、苜蓿青贮三者配比以70∶10∶20较优。

表6 不同比例优质饲草的组合效应Table 6 The combination effect of different proportion of high-quality forage treated 48 h in vitro with rumen fluid of beef cattle

3 讨论

3.1 优质饲草的肉牛体外瘤胃发酵产气性能

饲料在瘤胃中产生的气体主要来源于微生物对饲料中碳水化合物和蛋白质含碳部分的分解，体外产气量是反映瘤胃中微生物活性、饲料降解率及饲料总体可发酵程度的指标。其大小取决于可发酵有机物含量和瘤胃微生物活力，产气量大说明瘤胃微生物的活性高，对底物发酵越充分，若产气量低，则主要由于底物中可供微生物发酵产物不足所致[17,21-23]。快速降解产气量和慢速降解产气量反映饲料发酵前期和后期可降解部分，其值越大表示该阶段可发酵成分含量高。研究表明饲料中蛋白质、NDF、ADF等不易发酵成分含量越高,则产气量越低[24]。通常情况下，易发酵碳水化合物含量高的能量饲料在24 h之内GP就可达到最高峰,蛋白质饲料在48 h内产气量可达到高峰,但含结构性碳水化合物较多的粗饲料的产气量最高峰在48 h以后才出现[25]。本研究中的粗饲料为玉米青贮、燕麦青贮、苜蓿青贮和苜蓿干草，其结构性碳水化合物含量相较秸秆等低品质粗饲料较高，各粗饲料的最高GP均在48 h之后出现，且玉米青贮和燕麦青贮的发酵启动时间短，主要因为禾本科饲料相对豆科饲草含有更多的易发酵碳水化合物。其次，因不同饲料组合，其非结构性碳水化合物与碳水化合物比例及其碳水化合物与蛋白质比例间有所差异，致使在不同比例组合间的产气规律也有所不同。本试验中，C4(50%燕麦青贮+50%苜蓿干草)产气量相对最低，可能是该组合中的ADF和NDF含量相对较高，可供微生物发酵产物不足所致，降低了体外发酵的产气速率，从而产气量降低；同时C3(80%玉米青贮+20%苜蓿干草)产气量相对最高，究其原因可能是该组合玉米青贮含量高，且其含有更多的可发酵碳水化合物，并且CP和ADF含量较低等，有利于微生物发酵，提高其微生物活性，与杨志林等[26]的研究结果一致。

3.2 优质饲草在肉牛体外瘤胃发酵48 h的干物质消失率与发酵参数

饲料DMD是反映其被动物利用程度大小的重要指标，也是表示反刍动物机体消化利用饲料中有机物能力的重要指标，降解率越高，饲料的可利用程度就越高[27]。DM的降解主要是CP、EE和CF等物质的降解[28]，瘤胃碳氮比适中，更有利于微生物活动，亦对应高的DMD。本研究条件下，玉米青贮和燕麦青贮的DMD分别为81.73%、70.53%，相对较高，其玉米青贮的DMD高的原因是青贮后的玉米富含非结构性碳水化合物，可消化的有机物含量高，很容易被瘤胃微生物发酵利用；而燕麦青贮DMD高的原因可能是其碳氮比合适，更易被微生物利用。此外，亦有研究表明较低的饲料粗灰分和ADF含量会对应较高的DMD[29]，故而这也是玉米青贮和燕麦青贮DMD较高的原因之一。其次，C2(50%玉米青贮+50%苜蓿青贮)DMD最低，可能是因为含有较高苜蓿青贮，其非结构性碳水化合物含量低，不易被瘤胃微生物发酵利用。

瘤胃液pH是反映瘤胃内部环境与发酵水平的一项综合指标，瘤胃pH大小影响瘤胃微生物蛋白合成和微生物区系的稳定性，保证瘤胃正常发酵所需的pH范围为6～7[30]，其大小由诸多因素共同决定，包括日粮类型、唾液分泌和瘤胃代谢产物等[31]。一般情况，体外发酵培养液pH随着饲料发酵时间的延长而显著下降，主要因为发酵产酸增加及累积[32]。本试验中，虽然pH受粗饲料类型的影响，但4种单一饲料培养液pH (6.27～6.72)和7种组合培养液pH(6.40～6.69)均在适宜范围内，表明发酵48 h不会影响瘤胃微生物生长繁殖。

瘤胃液中氨态氮(NH3-N)不仅是瘤胃微生物分解含氮物质的产物，也是合成微生物蛋白的主要氮来源[33]。NH3-N浓度为瘤胃微生物合成菌体蛋白提供氮源，最佳NH3-N浓度有利于微生物生长繁殖的环境，若供应不足，则微生物合成受阻，动物生产性能降低，相反，过高则会加重机体氮代谢的负担[34]。一般情况下，瘤胃氨氮水平处于动态平衡状态，但瘤胃NH3-N的含量变动很大，其最佳范围为6.58～36.7 mg·dL-1[35]。Hoover[30]则认为，瘤胃微生物生长适宜氨氮浓度为3.3～8.0 mg·100 mL-1，由于日粮蛋白质及碳水化合物(CHO)发酵的差异，实际上瘤胃液中氨氮的变化幅度多在1～76 mg·100 mL-1，从而影响瘤胃微生物活性。本研究中，4种单一饲料和7种组合饲料的NH3-N浓度变化范围分别为18.87～38.12 mg·dL-1和5.69～22.53 mg·dL-1，其均在有关文献报道的范围内[30,36]，这说明其浓度可以确保瘤胃微生物的正常生长。其次，C6和C7发酵48 h时NH3-N浓度低于微生物发酵的最佳浓度下限。体外发酵体系中NH3-N的主要来源为微生物对底物含氮物质的降解，而生成的NH3-N有2个主要去向，一部分被微生物用来合成微生物蛋白(microbial protein, MCP)，另一部分溶解在发酵液中(发酵瓶不具有吸收和排出NH3-N的能力)。碳水化合物是限制瘤胃微生物利用NH3-N的主要因素。结合产气量及DMD指标，C6和C7发酵48 h时NH3-N浓度最低的原因可能生成的NH3-N被微生物所利用，与王珊等[37]研究报道相一致。

挥发性脂肪酸(VFA)是反刍动物的主要能量来源，为瘤胃微生物增殖提供主要碳架来源[38-39]，可为反刍动物提供60%～80%的可消化能[40]。挥发性脂肪酸浓度的高低说明了瘤胃中碳水化合物消化率大小[41]，同时，其含量及组成比例是反映瘤胃消化代谢活动的重要指标之一。乙酸作为合成体脂和乳脂的原料，能为动物提供所需的大部分能量；葡萄糖合成的前体物质为丙酸，能量转化效率均高于其他酸，因此丙酸型发酵能为机体提供生长和生产所需的能量[34]，从而可以进一步提高动物的生产水平和饲料利用率；而丁酸大部分以酮体的形式氧化。VFA浓度及比例的影响因素众多，有发酵底物结构(如纤维素和半纤维素发酵产生的乙酸比例较高，而淀粉等易发酵的碳水化合物发酵产生的丙酸比例较高[42])和各种微生物菌群的活性。反刍动物瘤胃内乙酸、丙酸、丁酸占总挥发性脂肪酸的比例分别为50%～65%、18%～25%和12%～20%[43]，据此推算，乙酸/丙酸范围应为2.0～3.6，且其值受到动物、饲料及饲养条件等因素的影响。本试验中，4种单一饲料和7种组合饲料的VFA的各成分中皆以乙酸的浓度为最高，乙酸、丙酸含量均介于上述范围的上限或偏高；其中玉米青贮的TVFA最高，A/P最低，表明玉米青贮在瘤胃中消化利用率高，进一步表明禾本科饲料易被消化吸收，与史卉玲等[44]研究结果相一致。

3.3 优质饲草的肉牛体外瘤胃发酵48 h的组合效应

本试验中不同比例饲草的组合效应指数可以看出，某一项指标的单项组合效应指数并不一定与综合组合效应指数结果相一致。诸多早期研究结果表明，只有结合多项指标对组合效应结果进行综合评定，才能从整体水平上得出更为准确、客观的结论[24,39,42]。此外，韩肖敏等[6]指出，饲料以相对适宜的比例组合后，营养成分间通过互补促进了微生物的生长,有利于促进养分的高效利用。本试验中各处理的组合效应指数均为正值，其中两两组合以C4(50%燕麦青贮+50%苜蓿干草)为最优，三者组合以C5(70%玉米青贮+10%燕麦青贮+20%苜蓿青贮)为最佳，表明合理的饲粮搭配，更有利于动物胃肠道微生态的平衡，近而有利于其对饲料养分的消化利用，相关机理有待进一步研究。

4 结论

本研究条件下，玉米青贮的体外发酵GP、DMD、TVFA及乙酸浓度均最高，发酵速度快；苜蓿青贮的体外发酵GP较低，发酵速度慢。各处理的组合效应由高到低依次为：50%燕麦青贮+50%苜蓿干草，50%玉米青贮+50%苜蓿青贮，70%玉米青贮+10%燕麦青贮+20%苜蓿青贮，50%玉米青贮+50%燕麦青贮，80%玉米青贮+20%苜蓿干草，65%玉米青贮+15%燕麦青贮+25%苜蓿青贮，50%玉米青贮+20%燕麦青贮+30%苜蓿青贮。