内生真菌对铁皮石斛种苗生长的影响

朱彦明，金锦游，崔永一*

(1.浙江农林大学 农业与食品科学学院，浙江 杭州 311300；2.岱山县农林水利围垦局，浙江 舟山 316200)

铁皮石斛(DendrobiumcandidumLindl.)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生草本植物，是我国传统名贵濒危中药材，具有很高的药用和经济价值。铁皮石斛的种植和培育时，往往因缺少有益的内生真菌参与，导致组培苗移栽成活率低，种苗生长缓慢、品质较差，这种状况限制了铁皮石斛产业的规模化发展[1]。

内生真菌不同于菌根真菌只能定殖在植物的根部，其存在于植物组织的内部，部分存在于根、茎、叶之中，在植物衰老组织中产生孢子[2]。内生真菌与宿主通过长期的协同进化，与生存在宿主表面的表面菌相比，有本质性的区别，具有更稳定的生态功能[3]。研究发现，内生真菌能够与植物建立互惠共生的关系,提高植物对营养元素的吸收,促进植物的生长，提高植物对虫害、病害的抗性和对非生物胁迫的耐受性[4]。

本试验采用3种内生真菌与铁皮石斛种苗共生培养的方法，探讨内生真菌对铁皮石斛种苗生长的作用，旨在构建铁皮石斛共生培养体系，寻求能够有效促进铁皮石斛种苗生长、品质提升的新途径，为铁皮石斛仿生态栽培、生物肥(菌剂)的研究和应用等方面提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

已移栽驯化的一年生铁皮石斛种苗，该种苗来自于杭州市临安成蹊农业科技开发有限公司所生产的天斛一号组培苗。将长势一致且生长健壮的铁皮石斛种苗种植于直径17.5 cm的花盆中。

1.2 处理设计

采用完全随机试验设计，共2个因子，分别为供试菌株(FC6、FC8、FC9)和接种体积分数(20%、40%、60%)。以无菌水浇灌为对照(CK)，处理1～3接种FC6浓度分别为20%、40%和60%，处理4～6接种FC8浓度分别为20%、40%和60%，处理7～9接种FC9浓度分别为20%、40%和60%。每处理20盆。由于铁皮石斛具有较强的群体生长效应[5]，本试验将种苗以每丛为单位开展研究和生物量测定。试验材料每盆3丛，共6～9株，重复3次。在常规施肥基础上(基肥：奥绿肥，每盆5～8颗，3～4个月施用1次。追肥：花宝二号，稀释1 000倍，春、秋季每半月喷施1次)进行菌液浇灌处理。其中，菌液共浇灌5次，间隔天数为15 d，每盆种苗每次浇灌菌液100 mL。共培养150 d后，调查统计各处理铁皮石斛种苗生物量，显微观察真菌侵染情况。另外从处理组和对照组种苗中随机抽取10盆进行重分离真菌，并鉴定。

1.3 金钗石斛内生真菌分离纯化

从金钗石斛较老的根部向上剪取4～6 cm的小段，洗洁精刷洗干净，流水下冲洗1 h；在超净工作台中用75%乙醇消毒1 min、0.1% HgCl2消毒6 min，最后再用无菌水冲洗3次[6]。无菌滤纸吸干根段表面水分后，先用剪刀把根段两端剪掉约3 mm，然后再剪成约1 cm长的小段，接于PDA(马铃薯、葡萄糖)固体培养基上，进行真菌的分离、纯化。另将最后一次冲洗过的无菌水接入PDA固体培养基上作对照，若表面无杂菌产生，表明金钗石斛根部表面消毒彻底。

1.4 内生真菌形态观察鉴定

将1.3节分离的菌株接种于PDA固体培养基上，然后放置在恒温培养箱内，暗培养温度设置为26 ℃。培养7～15 d后，通过菌落特征和显微观察初步鉴定筛选菌株。

1.5 内生真菌分子鉴定

将发酵培养(PDA液体培养基)的菌丝球用无菌纱布过滤，再用无菌滤纸吸干后放入研钵中，加入液氮快速研磨至粉末状，用CTAB法提取真菌基因组DNA，核酸分析仪检测DNA纯度和浓度。分别以通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′)为上、下游引物PCR扩增其ITS区。PCR反应体系为25 μL：Master mix(绿酶)12.5 μL，引物(稀释为10 μmol·L-1)ITS1和ITS4各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，加灭菌ddH2O至25 μL，混合均匀后离心。PCR条件为95 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，25 ℃保温。PCR反应结束后取4 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

用核酸分析仪检测扩增后的DNA纯度和浓度，取21 μL扩增产物送Sangon公司进行单向序列测通[7]。测序成功的核酸序列以AB1格式保存，运用Chromas软件进行两两比对。以每个形态型菌株的ITS和5.8S基因为靶序列，在GenBank数据库中用Blast程序搜索同源序列，与已知真菌碱基序列相似度大于或等于97%的菌株被鉴定到种水平，以此为标准鉴定分离纯化后的真菌科属[8]。

1.6 液体菌剂配制

将PDA固体培养基中的菌株用直径0.5 cm的打孔器在其菌落边缘打取2个菌饼，接种到300 mL PDA液体培养基中，在温度26 ℃、转速200 r·min-1条件下恒温暗培养约5 d，将悬浮在PDA液体培养基中的菌丝球打碎和发酵液一起与无菌水配制成不同浓度、均匀的液体菌剂[4]。

1.7 生物量测定

铁皮石斛种苗与内生真菌共培养150 d后，从处理组和对照组中各选取10盆长势均匀、健壮的植株，以每丛为单位测定植株的鲜质量、干质量、分蘖数、株高、茎粗、茎节数、根长、根条数和叶片数，并计算出各指标平均值。在SPSS 22.0软件中进行单因素方差分析和多重比较，采用Duncan法分析差异显著性。

1.8 共生结构观察

分别从铁皮石斛种苗处理组和对照组中随机抽取10盆，每盆取2～3条约5 cm长的根段，在流水下冲洗干净，剪成约0.5 cm长的小段。迅速放于FAA固定液中，酒精系列脱水、石蜡包埋、切片脱蜡、番红固绿染色。切片厚度为8 μm，光学显微镜400倍下观察真菌侵染情况并照相记录。

重分离真菌鉴定方法同1.5节金钗石斛根部真菌分离的分子鉴定法。

2 结果与分析

2.1 内生真菌rDNA ITS序列分析

用CTAB法提取从金钗石斛根部分离所得的3种真菌的菌丝体DNA，PCR扩增均得到单一的ITS片段。将PCR产物测序，获得3种真菌的rDNA ITS区段的序列，序列长度均在610 bp左右，测序结果在NCBI中利用BLAST与Genbank数据库中的已知真菌碱基序列进行比对，序列相似度均达到97%以上(表1)。其中菌株FC6和毛壳菌属ChaetomiumKunze真菌相似度最高；菌株FC8和蜡壳耳属Sebacinasp.真菌相似度最高；菌株FC9和踝节菌属Talaromycessp.真菌相似度最高。

表1 内生真菌ITS序列BLAST比对结果

2.2 内生真菌对铁皮石斛种苗生长的影响

由表2可知，不同菌株、不同浓度处理组对铁皮石斛种苗的鲜质量有不同的影响。60%菌株FC6处理组鲜质量最大，极显著高于对照组，是对照组的1.6倍。20%菌株FC6处理组显著高于对照组。60%菌株FC6、20%菌株FC8处理组的干质量极显著高于对照组，分别是对照组的1.76、1.63倍。菌株FC6和FC9处理组随着接种浓度的提高，铁皮石斛种苗的干质量逐渐增加，而菌株FC8处理组相反。铁皮石斛种苗经菌液处理后分蘖数明显增加，20%的FC6、FC8菌株处理组的分蘖数极显著高于对照组，分别是对照组的2.0、1.1倍。

表2 不同菌株和接种剂量对铁皮石斛种苗生长的影响

注：*与**分别表示与对照相比在0.05和0.01水平上差异显著。

60%菌株FC6处理组的株高显著高于对照组，是对照组的1.26倍。菌株FC9对铁皮石斛种苗的株高产生抑制作用。菌液处理对铁皮石斛种苗的茎粗影响较小。在茎节数方面，40%菌株FC8处理组比对照组多出2.72节。20%菌株FC6处理组铁皮石斛种苗的茎节数低于对照组，提高FC6接种浓度对茎节数的增加有明显的促进作用。

20%、40%菌株FC6和40%菌株FC8处理组的根长均极显著高于对照组，分别是对照组的1.74、1.62和1.44倍。菌株FC9处理组的根长小于对照组。20%菌株FC8处理组的根条数极显著大于对照组，比对照组增加10.92条。铁皮石斛种苗经菌液处理后叶片的数量有明显增加。20%、40%、60%菌株FC6，20%、40%菌株FC8和60%菌株FC9处理组均极显著多于对照组。

2.3 铁皮石斛种苗真菌侵染情况观察

铁皮石斛种苗根部显微观察表明，其结构由外到内依次为根被、皮层(外皮层、中皮层和内皮层)和中柱。最外层为根被，由4～6层长筒形、多角死细胞组成，细胞排列紧密，细胞壁增厚。中层为发达的皮层细胞，由10～12层薄壁细胞构成，分布有质粒、淀粉颗粒等结构；中心部分为中柱，是铁皮石斛根的输导组织，包括中柱鞘和维管束组织。维管束的数量不一，与其对环境的适应性具有一定的正相关性，另外与植株种类也有一定关系。针状结晶结构不均匀的分布于整个根部细胞中。

菌株FC6和FC8均能够侵入铁皮石斛种苗根部组织，其侵染方式是直接破坏铁皮石斛种苗根被组织进入皮层细胞，形成菌丝、菌丝结。菌株FC9侵染现象不明显。菌液处理组铁皮石斛根部外皮层细胞存在少量菌丝，此层细胞可以清晰地观察到菌丝由根被细胞向外皮层细胞侵入的现象(图1中A)。菌丝主要在皮层细胞内形成大量着色较深、形状不规则的菌丝结(图1中B)，多数存在于细胞核附近，原因是其围绕细胞核形成的。在种苗根部也发现细胞中柱外围的内皮层细胞中分布有大量淀粉颗粒(图1中E)，皮层细胞中存在着针状的结晶体，称为针状结晶(图1中F)，其排列不整齐、分布不均匀(表皮细胞中也有少量分布)，颜色较浅，容易识别。有研究表明针状结晶的化学成分为植酸钙镁[9]。

A，菌丝聚集在表皮细胞表面100×，(bar=200 μm)；B，皮层细胞内的菌丝结100×，(bar=200 μm)；C，菌丝团1 000×，(bar=20 μm)；D，菌丝缠绕细胞核现象400×，(bar=50 μm)；E，分布于皮层细胞的淀粉颗粒200×，(bar=100 μm)；F，皮层细胞内的针状结晶200×，(bar=40.6 μm)。P，菌丝结；CN，细胞核；HB，菌丝团；SG，淀粉颗粒；AC，针状结晶。图片均为铁皮石斛根部的横切面。图1 真菌侵染铁皮石斛种苗情况

2.4 重分离真菌及其rDNA ITS序列分析

对试验处理组和对照组铁皮石斛种苗根部进行重分离真菌，处理组均分离得到真菌，对照组未分离到真菌。其中，处理组真菌经纯化、形态观察后初步筛选出与原接种真菌相似的菌株，再分别提取其菌丝体DNA，PCR扩增均得到单一的ITS片段(图2)。将PCR产物测序结果与原接种真菌序列进行比对，序列相似度均达到99%以上，确定重分离得到了原接种真菌。

M，DL 2 000 Marker；6、8、9分别表示重分离筛选出的与原接种真菌FC6、FC8和FC9相似的菌株。图2 3种重分离菌株rDNA ITS基因电泳图谱

3 讨论

菌株FC6对铁皮石斛种苗的鲜质量、干质量、分蘖数、株高、根长和根条数均有显著促进作用。菌株FC8的促进作用主要表现在铁皮石斛种苗的分蘖数、根条数和茎节数3个方面。菌株FC9对铁皮石斛种苗的生长具有一定的抑制作用。本试验处理的菌株FC6和FC8分离自金钗石斛，但其对同为石斛属的铁皮石斛种苗生长也有显著的促进作用。郭顺星等[10]曾在金钗石斛中分离获得1种能促进铁皮石斛幼苗生长的菌株，同时也从铁皮石斛根中分离获得3种能促进金钗石斛幼苗生长的菌株。另有研究发现，分离自野生美花石斛的菌根真菌对同属的铁皮石斛和重唇石斛也有较好的促生效果[11]。这种现象体现了一种植物对多个菌株、一个菌株对多种植物的潜在专一性，以及兰科植物同属之间真菌的相似性。

孟娉等[12]研究表明，内生真菌混合接种均具有正效应，但不是全部优于单一接菌。混合接种的效果与混合的方式和方法有关系，这可能是因为共生真菌之间在接种势、菌丝发展、菌根分泌物、根系生理变化和养分吸收等方面产生了抑制或排斥[13]。而本试验是采用单一菌株的接种方式处理铁皮石斛种苗，与混合菌株接种方式的效果差异尚待进一步探讨。

石蜡切片法观察铁皮石斛种苗根部组织发现，菌株FC6和FC8均能够在皮层细胞定殖，形成菌丝、菌丝结，表明这2种真菌可以与铁皮石斛种苗形成典型的共生结构和良好的共生关系，为铁皮石斛的有益真菌。菌株FC9也可以侵入铁皮石斛种苗根部根被细胞和少量皮层细胞，但侵染形成的菌丝、菌丝结现象不明显，对铁皮石斛种苗的生长产生抑制作用，表明其不能和铁皮石斛种苗形成共生结构。这可能是相对于另外2种菌株而言，菌株FC9侵染力较弱，无法在有限的时间内与铁皮石斛种苗形成共生关系[14]。

真菌菌丝多集中分布在铁皮石斛种苗根部中皮层细胞，而在靠近中柱的内皮层细胞和中柱内分布较少。在铁皮石斛种苗根部皮层细胞中，真菌多以1条或多条菌丝卷曲，呈现出典型的菌丝圈结构，或变为零碎的菌丝段[15]。一方面真菌利用发达的菌丝帮助寄主植株吸收生长发育所需的碳源、氮源、矿质营养[16]、水分等物质，直接促进植株生长发育；另一方面，消解的菌丝为兰科植物提供营养物质，菌丝被消解后的复合物中有的成分扮演着诱导子的角色，而后者更为重要[17]。本试验中菌株FC6和FC8在提高其菌液的接种剂量时，铁皮石斛种苗的鲜质量、干质量和茎粗等均有增加，这可能与真菌利用其发达的菌丝和消解的菌丝为铁皮石斛种苗直接或间接提供营养物质有关。