一株解淀粉芽孢杆菌抑菌成分的分离与抑菌特性

2019-09-24徐燕尔丁鹏辉陈明路

浙江农业科学 2019年9期

徐燕尔，丁鹏辉，陈明路

(浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安 31300)

微生物污染作为生活中的常见污染问题对人类的生活产生了极大影响，它不但会导致食品腐败变质丧失食用价值，而且还会引起食物中毒，危害人体健康[1]。目前防止食品微生物污染的主要途径是使用化学防腐剂防腐，但化学防腐剂的频繁和大量使用导致微生物耐药性逐年增加[2]。因此，可持续发展的生物防治成为解决这一问题的有效手段。芽孢杆菌作为一种极具生防价值和开发潜力的菌种[3]，在生物防治领域占据较大的比重。

解淀粉芽孢杆菌具有较强的次生代谢产物产生能力，能产生多种抑菌物质[4]。目前，对解淀粉芽孢杆菌的研究成果较多。邱思鑫等[4]和王德培等[5]分别从烟草茎秆和青贮玉米秸秆中分离得到内生芽孢杆菌——解淀粉芽孢杆菌TB2和对丝状真菌具有抑制作用的解淀粉芽孢杆菌BI-2。杨胜远等[6]、朱晓飞等[7]和陈成等[8]分别从不同土壤样品中分离出具有生物拮抗性的解淀粉芽孢杆菌K6、YB-3和对黑曲霉、稻瘟病菌等具有较强抑制作用的解淀粉芽孢杆菌HN06。权春善等[9]从堆肥中分离到1株对植物病原菌尖孢镰刀菌具有强抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌Q-12。这些结果表明，解淀粉芽孢杆菌的提取源会影响解淀粉芽孢杆菌的作用菌种和抑菌强度。本研究从水藻样品中筛选分离菌株，用酸沉法、硅胶柱层析得到抑菌组分，并通过特性分析抑菌组分特性。

1 材料与方法

1.1 材料

无花果和若干常见水草，小猪肠道粪便；LB固体培养基，LB培养液，胰酪大豆胨液体培养基，PDA固体培养基；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由浙江农林大学本科实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分离纯化

取水草加一定量灭菌0.9% NaCl和灭菌石英砂，碾磨均匀。80 ℃加热30 min，取100～200 μL涂布于LB培养基，30 ℃培养1 d，挑取单克隆菌落于LB培养液中，200 r·min-130 ℃摇床培养24 h[10]。浙江农林大学东湖校区东湖瀑布附近采摘的马藻菌落标记为B1系，金鱼藻的菌落标记为B2系；取自云南无花果的菌落标记为Y系；取自临安无花果的菌落标记为L系；取自小猪肠道粪便的菌落标记为G系。

1.2.2 拮抗菌的筛选

将分离菌株在LB培养液中培养24 h，取5 μL菌液至涂布了10 μL金黄色葡萄球菌的LB固体培养基，30 ℃培养24 h，观察抑菌圈大小[11]。

1.2.3 16S rDNA序列鉴定

以27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′GGTTACCTTGTTACGACTT-3′为引物，扩增16S rRNA。PCR扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，32个循环；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳30 min，紫外灯观察拍照。PCR产物回收纯化并测序，将所测得的序列与GenBank(hppt://www.ncbi.nim.nih.gov)中的16S rDNA序列进行Blast分析[12]，以16S rDNA基因序列同源性>99%为鉴定标准。

1.2.4 抑菌物质的粗提

粗提物成分。依据邹远军等[13]方法，将1.6 L发酵上清液8 000g离心10 min，得到上清液和下沉细胞。用1 mol·L-1HCl调节上清液pH值至2.5，4 ℃静置12 h，然后8 000g离心上清液10 min，得到上清酸沉粗提物；下沉细胞加入20 mL甲醇超声波处理30 min，4 ℃静置12 h，8 000g离心10 min，旋转蒸发上清，得到下沉细胞粗提物，并用甲醇溶解。以金黄色葡萄球菌为指示菌，分别检测确定其抑菌活性后，比较得到抑菌效果更好的成分，保留在4 ℃冰箱贮藏备用。

1.2.5 培养基对抑菌效果的影响

分别取30 μL原始菌种，接种在涂布了100 μL金黄色葡萄球菌的LB固体培养基和胰酪大豆胨固体培养基上，30 ℃培养箱内培养24 h，观察抑菌效果。

1.2.6 培养时间对抑菌效果的影响

分别取5 μL原始菌种分别接种于5 mL LB液体培养基和胰酪大豆胨液体培养基，30 ℃，200 r·min-1摇床培养，培养24、48、72 h。然后分别取30 μL培养液接种在涂布了100 μL金黄色葡萄球菌的LB固体培养基和胰酪大豆胨固体培养基上，培养24 h，观察抑菌效果。

1.2.7 扩大培养

根据张宝[3]的扩大培养方法，用酸沉法得到抑菌效果更好的成分，加入蒸馏水溶解，把pH值调回7.0后放入冷冻干燥器冷冻48 h，4 ℃冰箱贮藏备用。

1.3 解淀粉芽孢杆菌所产脂肽的纯化鉴定

取一定量的提取物溶解在6 mL甲醇中，用硅胶色谱柱萃取脂肽提取物，依次以100% CHCl3，CHCl3、CH3OH体积比95∶5、90∶10、75∶25、70∶30、50∶50和100% CH3OH洗脱[14]，每次加200 mL，以金黄色葡萄球菌为指示菌，观察各组分的抑菌效果。

1.4 解淀粉芽孢杆菌分离组分的特性研究

1.4.1 pH值对抑菌活性的影响

将分离组分按一定比例添加于pH值为2～12的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，室温保持2 h后再将各管的pH值调至7.0，并定容至相同体积。以定容至相同体积的未处理样品作为对照[3]，金黄色葡萄球菌为指示菌，比较pH对抑菌活性的影响。

1.4.2 温度对抑菌活性的影响

将分离组分分别在60、80、100 ℃水浴加热30、60、90 min。以未处理的样品作为对照，金黄色葡萄球菌为指示菌，分别测定其抑菌活性，考察温度对分离组分活性的影响。

1.4.3 蛋白酶水解对抑菌活性的影响

取一定浓度的分离组分溶液，分别加入胰蛋白酶、蛋白酶K，使酶的终浓度为1 mg·mL-1，37 ℃处理2 h，调反应液pH值为7.0。以未处理的样品作为对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，考察蛋白酶对分离组分活性的影响。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌分离纯化与筛选

为研究附生于水藻的芽孢杆菌的抑菌活性，从不同水藻分离了24株芽孢杆菌，分析了其对金黄色葡萄球菌的抑制活性。根据菌种对金黄色葡萄球菌的抑制情况，筛选出8株抑菌效果较好的菌株，分别为B1-7、G-1、B1-6、B1-9、B1-6b、B2-f、B2-6、B2-5(表1)。

表1 分离菌株的抑菌效果

注：+为抑菌圈直径>1.5 cm，++为抑菌圈直径>2.0 cm，+++为抑菌圈直径>2.5 cm，-为抑菌圈直径<1.5 cm，--为抑菌圈直径<1.0 cm。

2.2 形态学与16S rDNA序列鉴定

筛选的菌株在LB液体培养基中形成菌膜，在LB固体培养基上菌落呈淡黄色，不透明，表面粗糙，边缘不规则；肉汤培养基中向上混浊生长，震荡后管底沉淀生长。序列分析表明，各菌株的16S rDNA序列与GenBank中解淀粉芽孢杆菌的16S rDNA序列同源性>99%，表明这8株菌株均为解淀粉芽孢杆菌。

2.3 抑菌效果

2.3.1 粗提物的抑菌效果

由表2可知，各菌株上清液酸沉提取物的抑菌效果差异显著，下沉细胞提取物抑菌效果差异较小。其中，B2-6菌株的上清液酸沉提取物抑菌效果最好，所以取B2-6上清酸沉提取物进行后续试验。

表2 B2-6菌株粗提物各成分浓度

2.3.2 培养基和培养时间对抑菌效果的影响

由表3可知，培养时间对B2-6菌株抑菌活性影响不显著，相比LB培养基，胰酪大豆胨液体培养基更适合培养解淀粉芽孢杆菌。因此，采用胰酪大豆胨液体培养基培养B2-6菌株24 h，再接种于胰酪大豆胨固体培养基进行后续试验。

表3 培养基和培养时间对B2-6菌株抑菌效果的影响

2.4 硅胶柱层析组分的纯化鉴定

以氯仿体积分数为0、100%、95%、90%、75%、70%、50%洗脱液获得的洗脱组分中，抑菌物质浓度分别为0.125 2、0.170 2、0.299 8、0.191 3、0.131 8、0.014 9、0.004 3 mg·mL-1。由图1可知，纯甲醇洗脱的组分抑菌活性最好。因此，后续试验取纯甲醇洗脱组分进行抑菌特性分析。