N-(5-对氟苄叉基绕丹宁)环丙沙星酰胺衍生物对人肝癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响

梁红霞，陈超然，伊 丹，余令兵，康玉华，胡国强，刘 彬

(河南大学1. 护理与健康研究所、2. 淮河临床学院、3. 药学院，河南 开封 475004)

氟喹诺酮类药物是广泛使用的临床一线抗感染药物，经过结构修饰有可能将此类药物改造成为抗肿瘤药物[1-2]。本研究用酰胺基作为氟喹诺酮C-3羧基的电子等排体，绕丹宁环为其修饰基，对氟苄叉基为修饰基的功能修饰侧链构建绕丹宁不饱和酮骨架，运用药效团拼合药物设计原理，设计合成了一系列N-(5-芳苄叉基绕丹宁)氟喹诺酮类衍生物，并进行了抗肿瘤活性筛选。结果显示，该类衍生物均具有较好的抗肿瘤活性，其中1-环丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-N-(5-对氟苄叉基-绕丹宁-3-基)-喹啉-4-(1H)-酮-3-甲酰胺(HGQ-15)活性最强，IC50值达3.89～4.53 μmol·L-1，具有进一步研究和开发的价值。在对新合成化合物的研究过程中，发现抗肿瘤药能够诱导肿瘤细胞自噬，并对肿瘤细胞的增殖和凋亡产生影响[3]。自噬现象可能是影响药物疗效和产生耐药机制的重要因素，是药物研究开发中需要重视的问题[4]。本文通过检测HGQ-15对人肝癌SMMC-7721细胞株的作用，初步研究了HGQ-15抑制细胞增殖，促进细胞凋亡以及与自噬作用的关系，为该类化合物抗癌作用的应用和开发提供一定的体外实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料人肝癌细胞系SMMC-7721，购自中国医学科学院基础医学研究所。N-(5-芳苄叉基绕丹宁)环丙沙星酰胺衍生物，由河南大学化学生物学研究所设计合成，HPLC法测定纯度>99%。四甲基偶氮唑盐(MTT)(Solarbio公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(七海复泰公司)；Trigol总RNA提取试剂、鼠抗人β-actin单克隆抗体(鼎国昌盛公司)；兔抗LC3B多克隆抗体(Sigma)；氯喹(chloroquine，CQ)(Santa Cruz公司)。凝胶成像系统(UVP公司)；流式细胞仪(艾森公司)。

1.2 MTT法测定细胞存活率SMMC-7721细胞以1.5×107·L-1浓度接种于含HGQ-15的培养液培养，加入5 g·L-1MTT 20 μL培养4 h ，加入DMSO 150 μL振荡溶解,测定570 nm处的吸光度(A)值并计算存活率。

1.3 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡400 μL 1×Binding buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，避光孵育15 min。加入10 μL PI染色液，冰浴5 min，流式细胞仪检测，激发光波长为488 nm。

1.4 Western blot法检测细胞LC3表达低温提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE分离样品，转膜，封闭。一抗(1∶500)4 ℃震荡孵育过夜，二抗(1∶5 000)室温震荡孵育2 h，ECL显影。

1.5 Beclin-1基因沉默实验Beclin-1 siRNA的干扰正义序列：5′-UGAAUGAGGAUGACAGUGATT-3′，反义序列：5′-UCACUGUCAUCCUCAUUCATT-3′；正义序列：5′-UUCUCCG AACGUGUCACGUTT-3′，反义序列：5′-ACGUGACACGUUCGG AGAATT-3′。转染使用siRNA-Mate转染试剂，按试剂盒说明操作。

2 结果

2.1 HGQ-15抑制SMMC-7721细胞增殖HGQ-15(0.625～10.0 μmol·L-1)处理SMMC-7721细胞24、48、72 h，对细胞增殖有明显抑制作用(P<0.05)，不同浓度HGQ-15对SMMC-7721细胞增殖抑制率数据见Tab 1。24、48、72 h的IC50分别为4.531 μmol·L-1(r2=0.874 2)、4.063 μmol·L-1(r2=0.857 3)和3.894 μmol·L-1(r2=0.959 0)。

Tab 1 Proliferation inhibitory ratio of HGQ-15 on SMMC-7721 cells

2.2 HGQ-15诱导SMMC-7721细胞凋亡随着HGQ-15浓度增加，凋亡细胞明显增多，细胞凋亡率见Tab 2。与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。

Tab 2 Effects of HGQ-15 on apoptosis of SMMC-7721 cells

2.3 HGQ-15对SMMC-7721细胞自噬的影响不同浓度HGQ-15处理24 h后，SMMC-7721细胞LC3-Ⅱ的表达量增加，表明HGQ-15诱导SMMC-7721细胞发生自噬。

2.4 Beclin-1 siRNA和氯喹对HGQ-15抑制细胞增殖作用的影响Beclin-1 siRNA对SMMC-7721细胞增殖率的影响不明显，但Beclin-1 siRNA与HGQ-15(2.5 μmol·L-1)共同处理组细胞增殖率明显低于HGQ-15(2.5 μmol·L-1)单独处理组(P<0.05) ；单独使用6.25 μmol·L-1氯喹时，对SMMC-7721细胞增殖率影响较小，但氯喹与HGQ-15共同处理后，明显增加HGQ-15对细胞增殖的抑制效果(P<0.05)。

2.5 Beclin-1 siRNA和氯喹对HGQ-15诱导细胞凋亡的影响与HGQ-15(2.5 μmol·L-1)单独处理组相比，HGQ-15(2.5 μmol·L-1)联合Beclin-1 siRNA组细胞凋亡率明显增高；HGQ-15(2.5 μmol·L-1)联合氯喹(6.25 μmol·L-1)组的细胞凋亡率也高于HGQ-15(2.5 μmol·L-1)单独处理组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

已有研究证明，通过改造碳-3羧基的氟喹诺酮衍生物显示出类似DNA拓扑异构酶Ⅱ毒剂的作用，能导致DNA损伤，诱导细胞凋亡[5]。本研究应用MTT法检测HGQ-15对SMMC-7721细胞增殖的影响，IC50值达到4.531 μmol·L-1。AnnexinⅤ-FITC/PI双染法观察HGQ-15对SMMC-7721细胞凋亡的影响，观察到随着HGQ-15浓度升高，凋亡细胞的比率明显。说明HGQ-15对SMMC-7721细胞的抑制作用与诱导凋亡作用有关。

本实验用Western blot方法检测自噬标志物LC3的表达，显示HGQ-15处理组表达量明显高于对照组，说明HGQ-15能够诱导细胞发生自噬。为探究HGQ-15诱导自噬与凋亡的关系，本研究应用RNA干扰技术下调自噬通路中关键蛋白Beclin1[6]和自噬抑制剂氯喹，阻断自噬体和溶酶体融合形成自噬溶酶体的过程[7]，特异性抑制细胞自噬活动，观察自噬对细胞增殖和凋亡的影响。结果显示，Beclin-1基因沉默和氯喹(6.25 μmol·L-1)本身对细胞增殖影响甚微，但与HGQ-15联用后，可明显增加HGQ-15对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用(P<0.05)。与此相一致的是，Beclin-1基因沉默和氯喹(6.25 μmol·L-1)与HGQ-15联合处理SMMC-7721细胞时，细胞的凋亡率明显高于HGQ-15单独处理组(P<0.05)。提示在HGQ-15导致SMMC-7721细胞凋亡过程中所诱导的细胞自噬，对细胞具有保护作用，通过自噬作用减少HGQ-15对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用，并降低细胞的凋亡率。