阿福豆苷对结直肠癌小鼠肿瘤抑制作用及其抗血管生成的影响

邢通潮，祝普利，尹超，马师洋，高鑫原

(1陕西省第四人民医院，西安710000；2西安交通大学第二附属医院；3西安市中医医院)

结直肠癌是临床病死率最高的消化系统恶性肿瘤之一，发病率高居全部恶性肿瘤的第4位，对广大患者的生命健康造成严重威胁[1～4]。大量研究结果证实，中医药治疗结直肠癌等恶性肿瘤具有较好的效果，提取自中药、具有较强抗肿瘤活性的天然产物更是抗癌药物研发的主要来源之一[5～7]。香睡莲是一种经典的中草药，具有较好的防癌抗癌、清热解毒、祛痰止咳及活血散瘀之功能，而其中糖苷类化合物是该中药的主要物质基础。阿福豆苷是提取自香睡莲水提取物的糖苷类化合物，具有较好的抗胰腺癌、抗菌及血管保护等活性。尽管近年来国内外对阿福豆苷的抗胰腺癌活性进行了一定的探讨，但研究均主要集中在体外研究，对其体内抗肿瘤活性并未进行阐述，且对其他类型恶性肿瘤的治疗作用亦未进行探讨。2017年3月～2018年12月，本研究采用BALA/c小鼠作为模型，探讨阿福豆苷对结直肠癌小鼠的治疗作用，并对其抗血管生成作用进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 BABL /c小鼠60只，体质量(21±2)g，雌雄各半，均购买自陕西省疾病预防控制中心。阿福豆苷购自美国Sigma公司(批号09092125)；人结直肠癌LOVO细胞由中国科学院昆明动物研究所季维智院士课题组惠赠，初次传代时间2018年2月；顺铂购自美国Sigma公司(批号09112983)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)、血管内皮生长因子(VEGF)及低氧诱导因子1α(HIF-1α)均购自美国Conning公司(批号分别为11092011、20198313、89910324及89102821)；胎牛血清、RPMI-1640培养液、胰蛋白酶、RPMI-1640培养基及10%标准小牛血清均购自上海安博广利生物科技有限公司(批号分别为0010921、09201921及20910921)。

1.2 分组方法 将60只BABL /c小鼠适应性喂养1周，饲养条件为标准饲料、55%湿度、昼夜各半及室温。随机分为顺铂组、模型组、高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组及低剂量阿福豆苷组，每组各12只。

1.3 结直肠癌模型建立及干预方法 按照文献[8]方法，在RPMI-1640全培养基中对结直肠癌LOVO细胞进行传代与培养，取细胞计数2×106/mL时的对数期结直肠癌细胞，按照0.2 mL/只的接种剂量将其接种于各组小鼠右前肢腋部皮下，接种后1周，检测各组小鼠右前肢腋部皮下肿瘤直径，将直径>10 mm时视为造模成功。顺铂组、模型组、高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组及低剂量阿福豆苷组分别成功造模11、10、11、11及10只。采用灌胃给药法对高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组及低剂量阿福豆苷组小鼠进行灌胃给药，给药剂量分别为阿福豆苷100、50、25 mg/kg；顺铂组给予顺铂15 mg/kg灌胃；模型组给予等量生理盐水灌胃。各组均灌胃1次/d，连续给药30 d。

1.4 各组小鼠肿瘤体积、重量及肿瘤抑制率检测 末次灌胃24 h后，采用脱颈法将各组小鼠处死，解剖并取其右前肢腋部皮下肿瘤组织，称取肿瘤组织重量。采用游标卡尺检测其长短径，计算肿瘤抑制率及肿瘤组织体积。肿瘤抑制率=(模型组小鼠肿瘤体积-其他组小鼠肿瘤体积)/模型组小鼠肿瘤体积×100%；肿瘤组织体积=(肿瘤组织长径×肿瘤组织短径2)/2。

1.5 各组小鼠肿瘤组织病理学观察 取各组肿瘤组织，用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片，采用HE染色法对各组肿瘤组织病理学情况进行观察，主要观测小鼠肿瘤细胞的凋亡情况，每个样本均取10个不同的视野。

1.6 各组小鼠血管生成相关蛋白表达检测 采用荧光免疫法。取各组肿瘤组织，依次进行抗原修复、一抗结合、二抗结合、复染及封片处理，采用荧光免疫法检测各组小鼠血管生成相关蛋白表达情况，主要观测指标为血管生成相关蛋白：金属肽酶含血小板反应蛋白1(ADAMTS1)、VEGF及HIF-1α，上述蛋白阳性表达均为橙红色。采用JA-3型显微照相系统进行拍照，采用Image-proplus6.0软件分析上述蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组小鼠肿瘤体积、重量及肿瘤抑制率比较 与模型组比较，顺铂组、高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组肿瘤组织重量及肿瘤组织体积均降低(P均<0.05)。与顺铂组比较，高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组肿瘤组织重量及肿瘤组织体积均增高，而肿瘤抑制率均降低(P均<0.05)。与低剂量组比较，高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组肿瘤组织重量及肿瘤组织体积均降低(P均<0.05)，而肿瘤抑制率则均增高(P均<0.05)。高剂量阿福豆苷组与中剂量阿福豆苷组肿瘤体积、重量及肿瘤抑制率差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肿瘤重量、体积及肿瘤抑瘤率比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，△P<0.05；与低剂量阿福豆苷组比较，﹟P<0.05。

2.2 各组小鼠肿瘤组织病理学比较 顺铂组肿瘤组织中癌细胞出现大面积凋亡及坏死，模型组肿瘤组织中癌细胞形态及染色情况均正常，癌细胞结构完整。高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组肿瘤组织癌细胞亦出现大面积凋亡，但程度均轻于顺铂组。见图1。

注：A～E分别为顺铂组、模型组、高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组。

图1各组小鼠肿瘤组织病理学比较(HE染色法，×100)

2.3 各组小鼠肿瘤组织血管生成相关蛋白表达比较 荧光染色结果显示，模型组肿瘤组织各血管生成相关蛋白VEGFR-2、VEGF及HIF-1α均呈强阳性表达，而顺铂组肿瘤组织中上述蛋白仅偶见表达，高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组肿瘤组织中上述蛋白均呈不同程度的阳性表达，但阳性表达量明显少于模型组，见图2～4。

半定量分析结果表明，与模型组比较，顺铂组、高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组肿瘤组织VEGFR-2、VEGF及HIF-1α相对表达量均降低(P均<0.05)。与顺铂组比较，高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组肿瘤组织VEGFR-2、VEGF及HIF-1α相对表达量均增高(P均<0.05)。与低剂量组比较，高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组肿瘤组织上述蛋白相对表达量均降低(P均<0.05)。高剂量阿福豆苷组与中剂量阿福豆苷组上述蛋白相对表达量差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

注：A～E分别为顺铂组、模型组、高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组。

图2各组小鼠肿瘤组织中VEGFR-2的表达情况(免疫荧光染色法，×400)

注：A～E分别为顺铂组、模型组、高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组。

图3各组小鼠肿瘤组织中VEGF的表达情况(免疫荧光染色法，×400)

注：A～E分别为顺铂组、模型组、高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组。

图4 各组小鼠肿瘤组织中HIF-1α的表达情况(免疫荧光染色法，×400)

注：与模型组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，△P<0.05；与低剂量阿福豆苷组比较，﹟P<0.05。

3 讨论

结直肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤之一，约占全部胃肠道癌症的第2位，由于其早期症状不明显，患者多无明显异常改变，或仅伴有轻微腹泻等不典型症状，故超过65%的患者就诊时已处于晚期阶段，无法接受手术治疗[1,3]。药物治疗是结直肠癌等恶性肿瘤的主要治疗方法，但目前临床常用的顺铂、卡铂及5-氟尿嘧啶等药物均存在部分患者效果不显著、长期使用可导致耐药性及部分药物毒副作用较大等不足，故寻找对结直肠癌具有显著疗效的新型治疗药物迫在眉睫[9～13]。随着现代天然药物化学的迅猛发展，天然产物用于恶性肿瘤的治疗越发受到重视，诸多来源于中药及天然药物的单体化合物在结直肠癌等恶性肿瘤治疗中的应用越来越广泛[14,15]。

阿福豆苷是一种提取自香睡莲中的黄酮醇糖苷，早期研究结果显示该化合物具有较强的抗炎、抗氧化应激、保护心血管及抗疟原虫等活性[16,17]。最新研究表明，阿福豆苷单体化合物对于前列腺癌细胞具有较强的抑制作用，其主要机制在于阿福豆苷可有效促进前列腺癌细胞的凋亡，抑制癌细胞肌动蛋白细胞骨架维护过程中相关激酶的表达[17]。此外，阿福豆苷在体外还可有效抑制血管生成相关蛋白的表达，从而抑制癌细胞在体外的浸润能力，降低其转移性[16]。尽管国内外对于阿福豆苷的抗前列腺癌活性进行了一定的探讨，但上述研究均主要阐述了该化合物的体外抗肿瘤活性，但对于该化合物的体内抗肿瘤活性研究则较少，而对于其抗结直肠癌活性的研究亦较少。鉴于阿福豆苷具有较好的抗结直肠癌应用前景，我们以BABL/c小鼠作为模型，探讨了阿福豆苷对于结直肠癌荷瘤小鼠的治疗作用，期望为该化合物的应用及结直肠癌的新药研发提供一定的依据。

大量证据显示，结直肠癌是典型的富血管恶性肿瘤，而血管生成作用可促进该疾病的发生与发展，对于加剧结直肠癌细胞的生长及浸润具有显著的作用[11]。VEGF是临床已发现的最重要的促血管生成因子之一，该蛋白可特异性结合结直肠癌病灶组织中血管内皮细胞表面受体，从而产生较强的促血管内皮细胞增殖及促新生血管形成等作用；VEGFR-2则是机体中常见的VEGF受体，可与VEGF蛋白相互结合，并诱导VEGF的合成与释放，介导多种促血管生成作用的信号传导，在结直肠癌的血管生成过程中起到重要作用[18～20]；HIF-1α可提高癌细胞对缺氧环境的耐受性，从而加剧恶性肿瘤细胞的侵袭性，该蛋白还可有效促进VEGF及VEGFR-2的分泌，最终产生促血管生成的作用[21～23]。本研究结果显示，与模型组比较，高剂量阿福豆苷组、中剂量阿福豆苷组和低剂量阿福豆苷组小鼠肿瘤组织重量及肿瘤组织体积均降低，且肿瘤组织癌细胞出现大面积凋亡，而VEGFR-2、VEGF及HIF-1α等血管生成因子的阳性表达量少于模型组，提示阿福豆苷具有较好的抗肿瘤作用，且其主要作用机制可能为抗血管生成作用，然而对于其具体作用机制仍尚不明确，后期还应该对该问题展开深入的探讨。

综上所述，阿福豆苷对结直肠癌小鼠具有较好的肿瘤抑制作用，具有作为抗结肠癌药物的潜力，值得深入发掘。