基于Rho/ROCK信号通路的针刺对高脂血症模型大鼠血管内皮保护机制研究

陶 欢，刘盛菲，凌 敏

(广州中医药大学，广州 510006)

高脂血症是指人体脂肪代谢或转运异常，血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等主要脂质成分超过正常范围。大量的研究表明，高脂血症是导致心脑血管疾病的主要危险因素，通过损伤血管内皮参与动脉粥样硬化、脑卒中、冠心病等心脑血管疾病的病理过程。因此，有效防治高脂血症、保护血管内皮功能对心脑血管疾病具有重要意义。Rho/ROCK信号通路近年来已成为心血管疾病研究的热点，研究表明其与动脉粥样硬化以及血管内皮结构改变、功能变化关系密切[1-2]。大量研究也表明，针刺能够有效改善血脂代谢，改善血管内皮功能[3]，但其作用机制尚不明确。本实验通过建立高脂血症大鼠模型，观察其一般状态及体质量变化，测定血脂4项以及血清水平，观察主动脉HE染色下形态学改变，采用Western blot 法检测主动脉RhoA、ROCK2、MLCP蛋白表达水平，探讨针刺改善高脂血症血管内皮功能的机制，为其临床防治高脂血症提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SPF级雄性SD大鼠30只，体质量(200±10) g，购于广州中医药大学实验动物中心。实验前所有大鼠均进行适应性饲养1周后，按随机数字表法分为空白组、模型组、针刺组各10只。

1.2 主要试剂及仪器

维生素D3注射液(1 ml:7.5 mg×10支/盒，上海通用药业股份有限公司)，NO试剂盒、ET-1试剂盒、Elisa试剂盒(南京建成生物有限公司), RhoA、ROCK2、MLCP抗体(美国 ABCAM 公司)，Synergy HTX多功能酶标仪(美国BioTek仪器有限公司)，海康YB2000电子天平(上海拓西电子科技有限公司)，TKY-BMC石蜡包埋机(湖北泰康医疗设备有限公司)，R239型轮转式石蜡切片机(湖北泰维科技公司)，TG-18 W高速离心机(济南来宝医疗器械有限公司)，902-ULTS超低温冰箱(美国赛默飞公司)，CX31光学显微镜(日本奥林巴斯公司)等。

1.3 饲养及模型制备

空白组给予普通饲料喂养，模型组及针刺组大鼠给予一次性腹腔注射维生素D360万单位/Kg，并配合高脂乳剂灌胃(高脂乳配方：吐温-80 20%+丙二醇30%+猪油20%+胆固醇10%+胆酸钠3%+丙基硫氧嘧啶1%)4周，并测量血脂4项确认血脂升高。造模成功后，空白组继续给予普通饲料喂养，模型组及针刺组大鼠给予高脂饲料饲养。

1.4 干预方法

从第5周开始空白组、模型组只做固定不进行任何治疗。针刺组选用双侧“脂三针”(内关、足三里、三阴交)，取穴方法参照《实验针灸学》[4]。内关直刺1 mm，足三里直刺7 mm，三阴交直刺5 mm，针刺后接英迪牌KWD-808-I电针仪，疏密波，频率5～25 Hz，强度以肌肉轻微颤动为度，每次留针25 min，每日1次，连续干预3周。

1.5 血清及血脂水平测定

实验结束后，使用真空管对腹主动脉采血2～3 mL， 3000 r/min 离心15 min分离血清。采用ELISA方法检测一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)含量，采用全自动生化仪检测血脂4项(TC、TG、HDL-C、LDL-C)水平。

1.6 HE染色观察主动脉形态学变化

实验结束后，随机切取主动脉组织并放入4%多聚甲醛中固定，脱水、包埋、切片、脱蜡至水、HE染色，在光镜下观察主动脉形态学改变并选取典型视野拍照。

1.7 Western blot法测定主动脉 RhoA、ROCK2、MLCP蛋白表达

取各组大鼠主动脉组织 100 mg，在均质匀浆机中完全摇匀， 1200 r /min 离心10 min取上清，BCA法测定蛋白浓度。依次灌胶上样、切胶、备膜、装膜、裁膜。加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温下孵育30 min，采用 ECL显色，凝胶成像系统进行曝光。内参采用GAPDH，以RhoA、ROCK2、MLCP与 GAPDH 的积分光密度比值作为其相对表达量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般状态及体质量变化

表1显示，整个实验过程中空白组大鼠表现活跃，精神状态良好，反应灵敏，毛发富有光泽，体质量增长稳定；4周后模型组、针刺组大鼠活动减少，精神倦怠，反应较迟缓，毛发枯黄无光泽，体质量增长较快，体型较肥胖；7周后模型组大鼠活动缓慢，精神状态萎靡，反应迟钝，体质量继续增长，针刺组大鼠较模型组上述一般状态改善，体质量降低。

表1 各组大鼠体质量变化情况比较

注：与空白组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

2.2 各组大鼠血脂4项比较

表2显示，与空白组比较，模型组大鼠TC、TG、LDL-C含量升高，HDL-C含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，针刺组大鼠TC、TG、LDL-C含量降低，HDL-C含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠血脂4项含量比较

注：与空白组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

2.3 大鼠血管内皮形态学变化

图1显示，光镜下空白组主动脉形态正常，各层分界清晰，内膜光滑完整，内皮细胞排列连续，血管平滑肌细胞排列规则整齐。模型组内中外膜三层分界不清，内膜严重增厚，内皮细胞损伤水肿，血管平滑肌细胞排列紊乱。针刺组主动脉形态较正常，各层边界较清晰，内膜尚完整，无明显增厚，病理损伤有不同程度改善。

2.4 各组大鼠血清NO、ET-1含量比较

表3显示，与空白组比较，模型组NO含量下降、ET-1含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，针刺组NO含量升高，ET-1含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)，说明针刺能升高高脂血症大鼠NO含量，降低其ET-1含量，对血管内皮具有保护作用。

2.5 各组大鼠血管内皮RhoA、ROCK2、MLCP蛋白表达比较

表3图2显示，与空白组比较，模型组RhoA、ROCK2、MLCP蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，针刺组RhoA、ROCK2、MLCP蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，说明针刺能降低相关蛋白表达，抑制Rho/ROCK通路激活。

图1 各组大鼠主动脉血HE染色(×200)

组别鼠数NO(umol/L)ET-1(pg/ml)RhoAROCK2MLCP空白组1081.56±5.4358.45±4.341.32±0.151.53±0.181.41±0.16模型组1048.38±4.96∗121.27±5.15∗4.17±0.23∗3.71±0.24∗4.93±0.32∗针刺组1067.29±4.62#74.42±3.76#2.81±0.19#2.45±0.21#2.75±0.16#

注：与空白组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

图2 各组大鼠血管内皮RhoA、ROCK2、MLCP蛋白表达比较

3 讨论

高脂血症是一种临床常见病、多发病，特别是近年来发病率逐年攀升，已成为脑卒中、冠心病等心脑血管疾病的主要病理因素。中医学认为，本病多为肝脾肾脏腑功能失调，气血化生运行代谢紊乱，导致痰浊、瘀血等病理产物夹杂，为本虚标实之证。针刺治疗本病具有很大优势，内关、足三里、三阴交为靳三针之“脂三针”穴组处方，临床验证疗效显著。内关穴为八脉交会穴之一，与阴维脉相通，主治心胸胃疾病，能理气、宽胸、和胃；足三里为足阳明胃之合穴、胃之下合穴，是治病保健第一要穴；三阴交为肝、脾、肾三阴经交会穴，可调节足三阴经及经络所属脏腑经气。三穴配合可理气健脾和胃，化湿祛痰除瘀。相关研究[5]表明，“脂三针”能有效降低血脂水平，调节整体内分泌代谢功能，还能改善高脂血症、动脉硬化、冠心病等心脑血管疾病的症状。

NO是最具代表性的血管舒张因子，ET是作用最强烈的血管收缩因子。生理状态下，ET可促进内皮细胞NO的释放，NO对ET导致的血管收缩可进行负性调节以抑制ET的合成释放。两者作为一对拮抗因子，其血管活性物质的相对平衡状态对调节血流动力、维持正常血管张力具有重要意义，常作为反映血管内皮功能的指标。本研究显示，模型组大鼠血管内皮形态学病理变化明显，内皮细胞脱落严重，内膜增生严重，血清NO合成减少， ET-1释放增多。而针刺组NO合成增加， ET-1表达降低，血管内皮病理损伤程度明显改善，说明针刺能较好地修复内皮结构并保护其功能。

Rho/ROCK信号通路在心血管疾病发病机制中具有重要作用，尤其对于血管内皮功能影响较大。Rho/ROCK信号通路主要包括Rho GTP酶和ROCK两部分。RhoA是Rho GTP酶中的典型蛋白，而ROCK是Rho下游靶效应分子中功能研究最为详细的分子。正常状态下，ROCK可调节血管内皮细胞的通透性，保护内皮屏障的完整性，增加NO 的生成，诱导血管舒张，促进单核细胞迁移。血管内皮损伤状态下，ROCK活化可抑制血管舒张，增加血管内皮通透性，并参与动脉粥样硬化斑块形成过程[6]。

在某些病理因素的刺激和诱导下，RhoA通过激活下游ROCK，ROCK的亚型ROCK2可直接引起MLCP磷酸化，增加血管平滑肌细胞收缩。本研究发现，模型组大鼠RhoA，ROCK2及其下游底物MLCP表达均增高，说明血管内皮功能障碍时Rho/ROCK信号通路处于激活状态，且蛋白活性变化趋势与ET-1相一致，而与NO变化趋势相反，血管舒缩功能异常，这也说明Rho/ROCK通路能调节血管舒缩，维持血管正常功能。这与相关研究Rho/ROCK通路激活可减弱 eNOS基因的稳定性使NO 表达下降的结论一致[7]。通过观察HE染色下主动脉形态学改变，提示针刺可以降低RhoA、ROCK2、MLCP表达量，增加NO活性，同时又可改善血管内皮损伤程度，所以推测针刺可能通过提高NO表达来抑制Rho/ROCK通路相关蛋白表达，以达到保护血管内皮功能的目的。

综上，针刺能够改善高血脂模型大鼠的精神状态，降低血脂水平，提高血管舒张因子NO 含量， 降低血管收缩因子ET-1含量，修复血管内皮损伤，改善血管内皮功能，推测可能与抑制Rho/ROCK通路激活有关。因此，针刺能较好地改善高脂血症以及相关心脑血管疾病，本研究结果对临床推广具有积极作用。