黄瓜枯萎病拮抗菌株的筛选及其生物防效

王丽丽，朱诗君，金树权，周金波，徐强

(宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040)

黄瓜枯萎病(cucumber fusarium wilt)是由黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌-黄瓜转化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)入侵植株而引起的黄瓜常见土传病害，该病原菌的侵染方式为根部侵染[1]，在露地和保护地栽培黄瓜上均可发生，连作土壤中尤其严重。尖孢镰刀菌能在土壤中存活10～15年，黄瓜种子亦可带病菌[2]，该病现已经成为全球范围内影响黄瓜生产的毁灭性病害。日常农业措施易导致黄瓜植株地上部伤口重复感染，在感染枯萎病初期，黄瓜叶片中午萎蔫下垂，早上和晚上恢复，后期整株枯死[3]。

目前，农业生产上主要采用田间轮作和植株嫁接的方式来防治病害，常常和施用农药一起配合使用，这些方式往往效果不稳定，且会带来一系列健康和环境问题，因此，生物防治的理念越来越受到人们的重视[4]。生物防治是通过拮抗抑制作用采用一种生物防治另外一种生物的方法。芽孢杆菌可以形成耐高温、辐射、高酸碱等逆境的芽孢，因而筛选具备高拮抗活性的芽孢杆菌备受人们的重视。

罗文建等[5]在黄瓜根际土壤和根、茎中分离出对黄瓜枯萎病病原菌具有较强拮抗作用的细菌菌株，其对黄瓜枯萎病的盆栽防治效果达到66.03%。郑新艳等[6]用筛选得到的菌株防治马铃薯青枯病，发现拮抗菌株不仅能有效拮抗青枯病病原菌，还能提高被试土壤微生物的群落多样性，有助于克服土壤连作性障碍。本试验从黄瓜植株根际土壤中分离和筛选出能够抑制黄瓜枯萎病的高效拮抗菌株，通过分子鉴定初步确定为芽孢杆菌属，并且对其进行了田间防治试验研究，为黄瓜枯萎病的生物防治提供了科学依据和技术储备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 根际土壤的分离与保存

根际土壤的分离一般选自黄瓜枯萎病发病严重地块的健康植株根际土，本研究依据这一原则在鄞州、海曙、慈溪、江北、宁海、余姚等地共选择根际土壤39份。将健康黄瓜植株连根拔起，轻轻抖落根部大部分的土壤，将紧贴根的土壤连同部分须根一起收集，用封口袋装好，带回实验室放入4 ℃冰箱冷藏备用。

1.1.2 供试菌株和培养基

试验所用的黄瓜枯萎病病原菌株由本实验室筛选鉴定保存的1株尖孢镰刀菌黄瓜转化型菌株。

PDA培养基：马铃薯浸出液200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，加蒸馏水1 L，121 ℃灭菌20 min。

黄瓜枯萎病病原菌选择性培养基：磷酸氢二钾1.0 g，氯化钾0.5 g，七水硫酸镁0.5 g，乙二胺四乙酸铁(Ⅲ)钠0.01 g，L-天门冬酰胺2.0 g，D-半乳糖20.0 g，蒸馏水1 L，121 ℃灭菌20 min。待冷却至60 ℃左右时加入五氯硝基苯1 g，牛胆汁0.5 g，硼砂1.0 g，硫酸链霉素0.3 g，调节pH至3.8左右。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 L，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min。

1.2 黄瓜枯萎病拮抗菌的分离与筛选

微生物菌株的分离：称取1.1.1节中保存的根际土样10 g，依次放入含有90 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，放入摇床振荡30 min后用无菌水依次稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。取10-6、10-7和10-8各100 μL涂布至牛肉膏蛋白胨培养基，将培养基置于30 ℃培养。

拮抗菌株的筛选：将黄瓜枯萎病病原菌活化后用真菌打孔器打取直径6 mm的菌丝块置于PDA平板中间，将平板在28 ℃培养箱中培养48 h后，将分离到的细菌菌落用灭菌过的牙签点接于病原菌菌苔周围，28 ℃下恒温培养72 h，观察黄瓜枯萎病病原菌的生长情况及有无抑菌圈出现，将未接种细菌菌落的平板作为对照，选择抑菌效果好的菌株进一步进行划线纯化，将纯化后的菌株进行多次平板对峙试验，观察其抑菌效果是否稳定并计算其抑菌率。

1.3 菌株16S rDNA鉴定

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取拮抗菌株的全基因组DNA，所用的扩增引物为细菌16S rRNA 基因的通用引物：F：5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′；R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。反应程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存[7]。PCR产物经纯化后进行测序分析，测序结果在NCBI上进行16S rDNA序列同源性比较，然后用软件MEGA5.0以邻位法构建系统发育树，进行系统进化分析。

1.4 拮抗菌株对黄瓜枯萎病的生物防治效果

田间试验设置2个处理：处理1，施用等量清水；处理2，施用拮抗菌株发酵液(有效活菌含量1.0×1010mL-1以上)，每周1次，每株黄瓜灌根10 mL发酵液，总共施用3次。统计黄瓜枯萎病病情指数和计算防治效果[8]。

1.5 数据分析

数据采用Excel数据处理系统进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 黄瓜枯萎病拮抗菌株的分离与筛选

经筛选共分离出87株形态不同的拮抗菌株，通过对黄瓜枯萎病病原菌的初次筛选，其中11株具有抑菌效果，经过多次纯化及复筛发现，菌株15对尖孢镰刀菌的抑菌效果最好，且其抑制效果比较稳定，其抑菌率能达到51.2%(图1)。

图1 菌株15对黄瓜尖孢镰刀菌的平板抑制效果

2.2 拮抗菌株的16S rDNA基因鉴定

测序结果表明，菌株15的16S rDNA序列长度为1 421 bp。将菌株15序列在GenBank 数据库中进行Blast同源性检索，通过MEGA5.0软件以邻位法构建系统发育树(图2)，由系统发育树可知，菌株15与菌株BacillusamyloliquefaciensCAU B946(NC 016784.1)亲缘关系最近。

图2 菌株15与芽孢杆菌属相关菌株基于16S rDNA基因序列构建的进化树

2.3 拮抗菌株对黄瓜枯萎病的生物防治效果

从表1可知，施用菌株15拮抗菌菌剂能有效防治田间黄瓜枯萎病的发生。菌株15能有效降低黄瓜枯萎病田间病情指数，2次灌菌后的防效达到23.5%，灌菌3次后的防治效果能达到44.4%。

表1 拮抗菌株15对黄瓜枯萎病的田间防治效果

3 讨论

微生物是在土壤中广泛存在的，每克土壤中常有几亿到几百亿微生物，其在土壤中发挥着极其重要的作用，并处于平衡的发展，但目前农业生产上，由于化肥农药等化学元素的使用，使得土壤原有的微生物生态平衡被打破，导致土壤中有益微生物种群减少，有害微生物增多，最终导致植株病害增多。

目前，黄瓜枯萎病在生产上主要还依赖于化学农药的防治，虽然在一定程度上有效控制了该病害的危害，但仍旧无法从根本上解决该病的发生[9]。利用拮抗菌株防治植物土传病害目前已经有很多报道，拮抗菌株可在一定程度上改善土壤中微生物群落结构，进而对植株本身生长环境有益[10]，本试验从黄瓜根际土壤中分离出1株高效拮抗黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌的拮抗菌株，经过16S测序初步鉴定为芽孢杆菌属，对其田间生防效果进行试验，其对黄瓜枯萎病的防治效果最高可达44.4%。