2016—2018年四川地区猪流行性腹泻病毒流行病学调查与ORF3、S1部分基因序列分析

德西措姆，王 印，杨泽晓，姚学萍，罗 燕，廖倡宇，张鹏飞，江地科，项明源，姜瑞姣，宋 勇

(1.昌都市左贡县畜牧站，西藏 昌都 854499； 2.四川农业大学 动物医学院，动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130； 3.天津瑞普生物技术股份有限公司，天津 300300)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性接触性肠道传染病[1]，可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率越高，严重危害我国养猪业[2]。近年来，随着我国养殖业的快速发展，规模化、集约化猪场数增加，该病的发病率呈上升趋势，毒株类型呈多样化发展趋势[3]，危害日趋严重。

PEDV为冠状病毒科冠状病毒属成员，形态略呈球形[4]，平均直径80～120 nm，核衣壳呈螺旋对称，为二十面体对称[5]。PEDV的结构蛋白主要有4种：纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、囊膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)[6]。Park等[7]克隆了16个不同PEDV毒株的ORF3，发现致弱病毒较野生型病毒均缺失17个氨基酸，推测缺失的氨基酸与病毒病原性密切相关；Wongthida等[8]研究发现，PEDV的ORF3可编码1种调节病毒复制钾离子的通道蛋白，与PEDV发病机制有关，完整的ORF3对病毒离子通道的作用可增强PEDV的产生。

目前临床上对于PEDV的防控，主要是采用传统疫苗，随着PEDV变异菌株的流行，传统疫苗的防控效果逐渐下降[9]。我国于1976年首次报道PED，并于1980年首次分离到PEDV，此后在国内开始流行。1977年，比利时人从病料中分离出1株PEDV弱毒株，并命名为类冠状病毒CV777株[10]。2018年4月，随着Zhou等[11]报道的能引起仔猪腹泻等相似症状的猪只新型冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)，造成猪腹泻的病毒已呈种类繁多、株型多样化的现状，对于疾病的防控十分不利。

2017年冬、春两季，四川地区多地发生仔猪大规模腹泻，对养殖业造成巨大损失。初生仔猪死亡率上升，染病仔猪出现厌食、呕吐、脱水、消瘦等症状，粪便为黄色水样，并伴有腥臭味。经剖检发现，病猪小肠绒毛脱落，肠道内含大量乳样粪便，部分肾脏有出血点。本研究使用RT-PCR法对四川地区2016年6月至2018年6月发生腹泻的仔猪病料进行流行病学检测，同时选取4株来源不同、发病状况典型的PEDV感染样本，对其ORF3及S1基因高变区段进行序列分析，旨在为探讨当前我国PEDV发生发展的规律、疫苗的筛选及制定有效防控措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验病料

病料来自四川省遂宁、乐山、成都、绵阳等地猪场，共计71份，无菌采集腹泻仔猪小肠内容物和粪便，经反复冻融3次后，用生理盐水进行稀释，4 ℃ 5 000 r·min-1离心5 min，取上清于-70 ℃冻存备用。

1.2 主要试剂

病毒DNA/RNA提取试剂盒，细菌基因组DNA提取试剂盒，凝胶回收试剂盒，大肠杆菌DH5α等，天根生化科技(北京)有限公司；2×TaqPCR Master Mix，DNA分子标准，成都擎科生物科技公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit，宝生物技术(北京)有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计与合成

PEDV检测引物参照NY/T 544—2002《猪流行性腹泄诊断技术》，ORF3、S1基因扩增引物参照美国高毒株PC22A(GenBank No.KY499262.1)设计(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列

Table1Primer sequences

引物 Primers引物序列Primer sequences(5′-3′)长度 Length/bp位置 Position标准引物Standard primerP1: CCTAGACTTCAACCTTACGA77424 750～25 523P2: CAGGAAAAAGAGTACGAAAAORF3基因 OFR3 geneP1: TAGTGTTCTGCTGCATTTCC93124 690～25 600P2: TAAACTGCGCTATTACACAACCS1部分基因 S1 parital geneP1: TTGTGATGATCCTGTTAGC98822 022～22 987P2: AATACTCATACTAAAGTTGGTGG

1.4 样品核酸提取

取病料上清液，参照病毒DNA/RNA提取试剂盒操作说明书提取病毒和细菌核酸，用适量RNase free水溶解，-20 ℃保存备用。

1.5 病毒核酸检测及ORF3基因、S1部分基因扩增及测序

取提取的DNA作PCR模板，反应体系为：2×TaqPCR Master Mix 20 μL，ddH2O 10 μL，上下游引物各2 μL，模板4 μL。反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，34个循环；72 ℃ 10 min。将PCR产物纯化后，送至华大基因进行测序。

1.6 统计分析

采用圆形分布法[12]进行集中趋势分析，GraphPad Prism 5进行直观记录，计算发病高峰时点及高峰时期。圆形分布法的核心内容是将发病时间转换成角度来计算角均数，用角均数来表示疾病发病的高峰时点，并推算出相应的高峰时期。运用Excel对阳性病例及样本地区病史情况进行卡方检验，P<0.05为差异显著。

1.7 同源性分析及遗传进化树分析

测序结果利用DNAstar同源性分析、Mega 6.0软件进行分析。进化树采用Neighbor-joining方法1 000次举例进行绘制。

2 结果与分析

2.1 流行病学调查

2016年6月至2018年6月，共采集腹泻临床病例71例，实验室确诊PEDV感染病例35例。PEDV感染病例在腹泻总样本中，占比较大，达39%(表2)。PEDV发病状况呈明显的季节聚集性，PEDV高发期为冬、春两季，夏、秋两季发病状况较为好转。

如表3所示，通过对病史资料统计，发现发生PEDV的地区新疫源地所占比例较大，达61%。存在两年病史的猪场PEDV发病率低于1年病史猪场和新疫源地。老疫源地或有过病史存在的地区，发病数呈现下降趋势，表明PEDV防控取得良好的效果，但整体形式依旧严峻。

参考文献[12]，将2016—2018年四川部分地区PEDV月发病数转换为角度，结果见表4。根据圆形分布法基本公式，对PEDV发病高峰期进行预测，计算出PEDV发病高峰日为1月28日和2月11日，发病高峰时间为12月～3月，与实际调查结果一致。

2.2 PEDV ORF3基因及S1基因片段扩增

将选取的4株PEDV分别命名为scds1、scds2、scds3、scds4。扩增出的ORF3基因目的条带大小为931 bp，S1高变区段基因目的条带大小为988 bp(图1)。

表2PEDV流行病学调查结果

Table2PEDV epidemiological survey results

项目Item2016夏季Summer秋季Autumn冬季Winer2017春季Spring夏季Summer秋季Autumn冬季Winer2018春季Spring夏季Summer合计Total腹泻案例 Diarrhea case23117421721471PEDV数 PEDV number0174111110035PEDV比例 PEDV rate/%033645725506548039

表3PEDV阳性地区或猪场病史调查结果

Table3Results of PEDV-positive areas or pig farm history

项目Item两年内无病史No history of illnesswithin two years1年病史1 yearhistory2年病史2 yearhistory阳性数17114Positive number阴性数111724Negative number合计 Total282828阳性率613914Positive rate/%

表4 四川部分地区2016—2018年PEDV月发病数角度计算表

Table4Calculation of the incidence of PEDV in the two years from 2016 to 2018 in some parts of Sichuan

月份 Monthfαfsinαfcosα1915.29 2.373 3428.681 4312444.38 2.797 6562.858 8673773.48 6.711 0441.990 45044103.56 3.888 500-0.937 85053133.64 2.171 071-2.070 37060163.730071193.81 -0.238 700-0.971 09080224.380092254.47 -1.926 980-0.535 490100284.5500110314.6300125344.71 -1.318 5204.823 017合计Total35—14.457 40013.838 960

2.3 PEDV分离株同源性分析

将分离的4株PEDV菌株(scds1、scds2、scds3、scds4)与15株已有菌株(表5)的ORF3基因进行同源性分析，发现4株PEDV菌株与OH851、PC22A、GER/L00719/2014、CH/GDZH02/1401、CH/GDZHDM/1401在同一分支(图2)。通过对S1基因高变区进行同源性进化树的构建，将目前流行的毒株分成2个大群，4个亚型。scds1、scds2、scds3、scds4均属于GII群，与CH/GDZH02/1401、CH/GDZHDM/1401、PC22A、AJ1102等参考株同属一分支，为当前国内流行的PEDV变异毒株群。

通过对scds1、scds2、scds3、scds4菌株OFR3基因核苷酸序列进行比对，结果表明，以上4株与CH/GDZH02/1401、CH/GDZHDM/1401、PC22A等变异毒株同源性高达99%，其中scds1、scds2的ORF3基因的第158位、第259位发生突变分别为C→T、T→C。未发生弱毒株的碱基缺失现象，临床症状亦符合强毒株特征。S1基因高变区段碱基更替较大，与CH/GDZH02/1401等变异毒株同源性为92.8%～99.3%；与CV777、DR13等G1亚型的经典株亲缘关系较远，同源性为82.7%～87.3%。

3 讨论

猪流行性腹泻是一种对仔猪危害较大的传染病，多发于秋、冬、春3季。通过对四川地区近两年的PEDV流行病学资料的整理分析，发现该地区发病呈明显的季节聚集性，高峰期从12月持续至第2年的3月，与冠状病毒高发时间大致吻合。研究发现，经长期免疫防控的猪场PEDV感染率明显降低，可能是因长期的免疫接种和良好的生物安全措施致使带毒猪转为隐性感染状态，病毒感染的发病阈值提高，感染风险下降。而未有病史的猪场，由于缺乏对该病的防治手段，存在该病暴发流行的风险。

M，DL 2 000 marker；1，阴性对照；2，scds1；3，scds2；4，scds3；5，scds4。A，ORF3基因；B，S1基因。M， DL 2 000 marker; 1， Negative control; 2， scds1; 3， scds2; 4， scds3; 5， scds4. A， ORF3 gene; B， S1 gene.图1 PEDV ORF3、S1基因扩增结果Fig.1 PEDV ORF3， S1 gene amplification results

表5 毒株说明

Table5Description of the strain

编号No.株名Strains登录号GenBank No.分离年份Collectedyear分离地Collectedarea1AJ1102JX1884542012中国China2GER/L00719/2014LM6450582014德国Germany3PC22AKY4992622015美国USA4MNKF4687522013美国USA5CH-GDZH02-1401KR1533252014中国China6CH-GDZHDM-1401KR1533262014中国China7NPL-PEDv/2013/p10.1KM0523652014美国USA8CHN/SH/2016-4/2016MG8370122016中国China9IA1KF4687532013美国USA10OH851KJ3999782014美国USA11DR13JQ0231612012韩国Korea12Br1/87LT9065822017德国Germany13CV777AF3535112001比利时Belgium14LZCEF1859922007中国China15SM/98gbGU9377972011韩国Korea

图2 PEDV ORF3基因进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis based on PEDV ORF3 gene

图3 PEDV S1基因进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis based on PEDV S1 gene

PEDVORF3基因可编码钙离子通道蛋白，调节病毒产量与毒力，ORF3蛋白可抑制IFN-β mRNA转录，具有拮抗干扰素产生的功能[13]。同时，ORF3基因是鉴别PEDV强弱毒株的重要基因，本研究中，4株PEDV与国内外的变异高毒毒株的ORF3基因具有高度相似。近年来也有研究表明，PEDV可以通过PK15传代[14]，仔猪感染PEDV后，常见肾小球病变[15-16]。肾脏作为钾离子代谢的重要器官，富集较多的钾离子，推测PEDV增殖可能与钾离子浓度存在一定的相关性。

PEDV的S1基因核苷酸更替上具有明显的优势，通过对S1基因进行基因分型，可将PEDV划分为2个大群、4种亚种。本研究中，4株PEDV的S1基因高变区段与2014年广东、美国等地出现的PEDV高毒毒株归为同一分支，与CV777亲缘关系较远。当猪只感染PEDV时，由于毒株产生较大变异，易导致疫苗免疫效果不理想。通过对ORF3基因进行序列分析，未出现弱毒株部分核苷酸片段缺失情况，临床发病情况上也表现为强毒株特征，可通过对ORF3缺失情况与S1基因分型结果相结合，有针对性地进行疫苗毒株的初步筛选，对当前流行的PEDV进行防控。