复合微生物菌肥主要功能菌发酵培养优化研究

金开铭，田 彬，盛玉珍，熊咏梅，徐 磊，张 玲，王 丽*

(1.喜德县林业局，四川 喜德 616750；2.长江造林局攀枝花分局，四川 攀枝花 617000；3.四川省林业科学研究院,四川 成都 610081)

微生物肥料是一种带有活菌体的辅助性肥料，通过微生物种群间的生命活动及其代谢产物的共同作用，直接或间接地分解、合成能促进植物生长发育的物质，增强抗逆性、抗病虫性[1]。施用微生物肥料不仅可以增加营养物质，还因其含有大量的有益微生物，施入土壤后，通过有益微生物的大量繁殖而发挥其固氮、磷钾释放、扩大根系吸收面积和抑制有害病菌繁殖的作用。目前，微生物菌肥的使用已越来越广泛[2～8]，功能微生物菌群作为复合微生物肥料的核心部分，是微生物肥料生产中的关键技术。培养基配比及发酵条件对菌体生长的影响较大。胡秀芳[9]，杨铿[10]等均开展微生物菌肥主要功能菌发酵技术研究，探究其最佳的发酵条件，为规模化生产微生物肥料提供科学指导。

微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌先天的特性，而且还需要合适的发酵条件，这样才能使菌株的生产能力充分发挥出来。发酵条件的优化是菌株应用到实际生产中所经历的一个重要环节，直接关系到菌剂的质量和生产效益[11]。本研究选取微生物肥料中的主要功能菌即固氮菌、溶磷菌和解钾菌，利用单因素结合正交实验方案，筛选最适合菌株发酵生长的培养基及其发酵条件，为以后的微生物肥料的开发奠定理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

实验所用到的菌种固氮菌、溶磷菌、解钾菌菌种购自北京北纳创联生物技术研究院商城分院(BNCC)，菌种的详细信息分别为：

固氮菌：褐球固氮菌，Azotobacter chroococcum，资源编号BNCC192292，其他编号=BN24，用于生产固氮菌肥料。

溶磷菌：巨大芽孢杆菌，Bacillus megaterium，资源编号BNCC190686，可用于生产解磷细菌肥料。

解钾菌：胶冻样芽孢杆菌，Bacillus mucilaginosus，资源编号BNCC195271，钾细菌。

1.1.2 培养基

LB培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸馏水 1 000 mL，pH 值7.2～7.4，121℃灭菌19 min。固体培养基另加琼脂粉15 g。

基础发酵培养基：根据许净净等[17]的报道，基础发酵培养基采用葡萄糖5g、蛋白胨10 g、NaH2PO4.H2O 0.3 g、K2HPO40.5 g、MnSO4.H2O 0.2 g、蒸馏水 1 000 mL，pH值7.2～7.4，113℃灭菌19 min。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的活化

将保存在-70℃的菌种接种于新鲜的LB固体培养基上，连续活化两次，28℃恒温培养18 h。取新鲜LB固体培养基一环菌种，接种于LB液体培养基中，往复式摇床150 r·min-1，28℃恒温培养24h后备用。

1.2.2 生长曲线测定

采用比浊法测定菌体量：①将活化好的固氮菌、解磷菌、解钾菌接种到50 mL的LB液体培养基中，以未接种的培养基作为空白对照；②将培养液置于恒温摇床上以180 r·min-1的转速30℃振荡培养；③用分光光度计，从0时开始，每隔5h于波长600 nm处测定培养液的OD值，每次测定时以空白对照调仪器零点，每次取样2 mL；④以时间为横坐标，以OD值为纵坐标，制作曲线，即为细菌在该培养条件下的生长曲线。

1.2.3 培养基成分的筛选

(1)培养基碳源的优化

分别以5 g淀粉、麦芽糖、蔗糖、甘露醇替换基础发酵培养基中的葡萄糖，其他条件不变，250 mL三角瓶中装液量为100 mL，每个三角瓶中接入5 mL的菌液，于30℃，150 r·min-1条件下摇床培养。取对数生长期的菌液测其OD600值。

(2)培养基氮源优化

(3)培养基无机盐优化

采用以上单因子实验得到的最优碳源、最优氮源代替基础培养基中的碳源和氮源，无机盐分别采用FeCl3、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、ZnCl2，其他成分不变，方法同上。

(4)培养基优化正交实验

采用三因素三水平正交实验表，使用单因子实验所测定的最适碳源、氮源、无机盐配制不同浓度的发酵培养基，进行发酵培养，见表1。250 mL三角瓶中装液量为100 mL，每个三角瓶中接入1 mL的菌液，于30℃，150 r·min-1条件下摇床培养。取对数生长期的菌液测其OD600值。

表1正交实验设计

Tab.1 Orthogonal experimental design

1.2.4 发酵条件优化

建设学习小组的主要内容由建设小组凝聚力、学习氛围及合理安排成员分工三部分组成。小组凝聚力与学习氛围的建设要靠教师长期引导，而合理安排成员分工则要靠学生自主摸索，根据组内成员特长进行安排。一般而言，需要组长监督，语言能力强的学生进行发言提问，思维活跃的学生进行质疑，还要有学生进行知识总结等，但这些角色又是动态变化的，可以一人分饰多角。例如在学习《赠汪伦》一诗时，需要有学生发言提问，需要有古文功底深厚的学生进行知识点归纳，需要学生举一反三，还需要学生帮助组内成员提高。不管如何分配角色，都要保证组内成员有互帮互助精神，保证每位组内成员都能共同进步。

以优化的碳源、氮源及无机盐配制培养基，采用单因子试验进行最适pH、接种量、转速和培养温度优化。初始pH设置为6.4、6.8、7.2、7.6和8，接种量设置为1%、2.5%、4%、5.5%和7% ，转速设置为90 r·min-1、120 r·min-1、150 r·min-1、180 r·min-1和210 r·min-1，温度设置为22℃、26℃、30℃、34℃和38℃其他条件不变，方法同上。

1.2.5 数据处理

实验数据均为3次重复的平均值，采用Microsoft Excel 2003软件作图。

2 实验结果

2.1 生长曲线测定

通过测定OD600的吸光度值来反应菌液的菌体浓度。对数期的菌体生长代谢较为旺盛，将对数生长期的菌体接入发酵培养基，能缩短发酵周期，提高设备的利用率。从图1可知道，固氮菌在5 h左右进入对数生长期，30 h左右进入稳定期，在25 h左右进入对数生长末期，之后OD值变化不大，菌，体浓度达到最大，此时是菌株的最佳种龄。溶磷菌在2.5h左右进入对数生长期，30 h左右进入稳定期，在22.5h左右进入对数生长末期，之后OD值变化不大，菌体浓度达到最大，此时是菌株的最佳种龄。解钾菌在5h左右进入对数生长期，25h左右进入稳定期，在20h左右进入对数生长末期，之后OD值变化不大，菌体浓度达到最大，是菌株的最佳种龄。

图1 固氮菌、溶磷菌、解钾菌生长曲线Fig．1 The growth curve of the nitrogen-fixing bacteria,the phosphate-solubilizing bacteria and the potassium-releasing bacteria

2.2 最佳培养基成分的确定

2.2.1 最佳碳源、氮源、无机盐筛选

固氮菌最佳碳源、氮源、无机盐筛选见表2，从表中可以看出，当以麦芽糖为碳源时，菌液的浓度最大，其OD600为1.001，当以甘露醇为碳源时，OD600为0.677，菌液浓度最小，因此最佳碳源为麦芽糖。在最佳氮源的筛选实验中，当以蛋白胨为唯一氮源时，发酵液浓度最大，OD600为0.873，当以尿素为氮源时，OD600为-0.008，几乎没有发酵，故最佳氮源为蛋白胨。当以麦芽糖为碳源，以蛋白胨为氮源时，添加无机盐FeCl3和MgSO4·7H2O时发酵液的OD600分别为0.595和0.713，发酵效果较好，因此选择无机盐FeCl3和MgSO4·7H2O在正交实验中进行优化。

表2固氮菌培养基添加不同碳源、氮源和无机盐时发酵液OD600值

Tab.2 TheOD600ofthenitrogen-fixingbacteriaunderthedifferentCsource,theNsourceandtheinorganicsaltsource

碳源 OD600氮源 OD600无机盐OD600葡萄糖0.832蛋白胨0.873淀粉0.851NH4NO30.065FeCl30.595麦芽糖1.001酵母浸膏0.829MgSO4·7H2O0.713蔗糖0.875尿素-0.008CuSO4·5H2O0.017甘露醇0.677牛肉膏0.753ZnCl20.015

溶磷菌最佳碳源、氮源、无机盐筛选见表3，从表中可以看出，当以麦芽糖为碳源时，菌液的浓度最大，其OD600为0.857，当以甘露醇为碳源时，OD600为0.713，菌液浓度最小，因此最佳碳源为麦芽糖。在最佳氮源的筛选实验中，当以蛋白胨为唯一氮源时，发酵液浓度最大，OD600为0.814，当以尿素为氮源时，OD600为0.023，几乎没有发酵，故最佳氮源为蛋白胨。当以麦芽糖为碳源，以蛋白胨为氮源时，添加无机盐FeCl3和MgSO4·7H2O时发酵液的OD600分别为0.557和0.665，发酵效果较好，因此选择机盐FeCl3和MgSO4·7H2O在正交实验中进行优化。

表3溶磷菌培养基添加不同碳源、氮源和无机盐时发酵液OD600值

Tab.3 TheOD600ofthephosphate-solubilizingbacteriaunderthedifferentCsource,theNsourceandtheinorganicsaltsource

碳源 OD600氮源 OD600无机盐OD600葡萄糖0.753蛋白胨0.814淀粉0.792NH4NO30.141FeCl30.577麦芽糖0.857酵母浸膏0.729MgSO4·7H2O0.665蔗糖0.815尿素0.023CuSO4·5H2O0.009甘露醇0.713牛肉膏0.781ZnCl20.005

解钾菌最佳碳源、氮源、无机盐筛选见表4，从表中可以看出，当以甘露醇为碳源时，菌液的浓度最大，其OD600为0.529，当以蔗糖为碳源时，OD600为0.160，菌液浓度最小，因此最佳碳源为甘露醇。在最佳氮源的筛选实验中，当以牛肉膏为唯一氮源时，发酵液浓度最大，OD600为0.571，当以尿素为氮源时，OD600为0.002，几乎没有发酵，故最佳氮源为牛肉膏。当以为甘露醇碳源，以牛肉膏为氮源时，添加无机盐FeCl3和MgSO4·7H2O时发酵液的OD600分别为0.327和0.250，因此选择机盐FeCl3和MgSO4·7H2O在正交实验中进行优化。

表4解钾菌培养基添加不同碳源、氮源和无机盐时发酵液OD600值

Tab.4 TheOD600ofthepotassium-releasingbacteriaunderthedifferentCsource,theNsourceandtheinorganicsaltsource

碳源 OD600氮源 OD600无机盐OD600葡萄糖0.268蛋白胨0.257淀粉0.179NH4NO30.045FeCl30.327麦芽糖0.182酵母浸膏0.375MgSO4·7H2O0.250蔗糖0.160尿素0.002CuSO4·5H2O0.033甘露醇0.529牛肉膏0.571ZnCl20.105

2.2.2 培养基优化正交实验

实验选取L934正交表，利用上文单因素筛选出来的最佳碳源(A)、氮源(B)、无机盐(C和D)，每个实验重复3次，结果见表5～7。

固氮菌培养基优化的实验结果见表5，极差R表示各因素对菌体生长影响的强弱，由表中可知，影响固氮菌发酵液中菌液浓度的因素依次为R蛋白胨>R麦芽糖>R FeCl3>MgSO4·7H2O。K表示同一因素间不同浓度对菌体生长的影响，K1水平1，K2表示水平2，K3表示水平3，从表中可以看出，发酵结果最优的水平为A3B3C2D3，即葡萄糖浓度7.5g/L，蛋白胨浓度15 g·L-1，FeCl3浓度0.2 g·L-1，MgSO4·7H2O浓度为0.5 g·L-1时对菌体生长最为有利，此时最佳培养基的成分为麦芽糖7.5 g、蛋白胨15 g、NaH2PO4.H2O 0.3 g、K2HPO40.5 g、FeCl30.2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g。

表5固氮菌培养基优化正交实验表

Tab.5 Orthogonalexperimentaldesignofthenitrogen-fixingbacteria

注：K为每个因素同水平之和； T为K的均值； R极差。

表6溶磷菌培养基优化正交实验表

Tab.6 Orthogonalexperimentaldesignofthephosphate-solubilizingbacteria

因素A麦芽糖/(g·L-1)B蛋白胨/(g·L-1)CFeCl3/(g·L-1)DMgSO4·7H2O(g·L-1)OD60012.550.10.10.42622.5100.20.20.46432.5150.50.50.6904550.20.50.65155100.50.10.71165150.10.20.74577.550.50.20.67687.5100.10.50.73197.5150.20.10.770K11.5801.7531.9021.907K22.1071.9061.8551.855K32.1772.2052.0772.072T10.5270.5840.6340.636T20.7020.6350.6180.618T30.7230.7350.6920.691R0.1960.1510.0740.073

注：K为每个因素同水平之和；T为K的均值；R极差。

表7解钾菌培养基优化正交实验表

Tab.7 Orthogonalexperimentaldesignofthepotassium-releasingbacteria

因素A甘露醇/(g·L-1)B牛肉膏/(g·L-1)CFeCl3/(g·L-1)DMgSO4·7H2O/(g·L-1)OD60012.550.10.10.42622.5100.20.20.46432.5150.50.50.6904550.20.50.65155100.50.10.71165150.10.20.74577.550.50.20.67687.5100.10.50.73197.5150.20.10.770K10.9681.1091.2341.217K21.3691.1321.1941.324K31.5791.6931.5061.393T10.3230.3700.4110.406T20.4560.3770.3980.441T30.5260.5640.5020.464R0.2030.1940.1040.058

注：K为每个因素同水平之和； T为K的均值； R极差。

2.3 讨论

2.3.1 初始pH优化

从图2可以看出不同初始pH条件对菌株的生长有一定影响。具体来说，pH对固氮菌菌体生长的影响范围较宽，初始pH在6.8～8.0范围内，菌体均能较好生长。当pH值为6.4～6.8时，固氮菌的生长量呈上升趋势，当pH值为6.8～8时，生长量随着pH值的增大而减少，当pH值为6.8时，发酵液的OD600为最大，达到1.085，因此固氮菌的最佳发酵pH值为6.8。

对于溶磷菌来说，随着pH值得增大，菌体的生长量呈缓慢下降的趋势，当pH值为6.4时，菌体的生长量达到最大，因此溶磷菌的最佳发酵PH值为6.4。

对于解钾菌来说，随着pH值得上升，菌体生长量呈缓慢上升的趋势，之后随着pH的继续增大，菌体的生长量迅速下降，说明发酵液的pH过高不利于解钾菌的生长，当pH为7.6时菌体的生长量达到最大，因此解钾菌的最佳发酵pH值为7.6。

图2 不同pH值对菌株发酵生长的影响Fig. 2 Effect of the different pH on the growth of flora combination

2.3.2 接种量优化

接种量对菌体的影响如图3所示，对于固氮菌来说，当接种量在50 uL～100 uL时，菌体的生长量逐渐上升，当接种量在300 uL～400 uL，菌体生长量呈缓慢下降的趋势，说明高接种量并不利于菌株的生长，当接种量为100 uL时，菌体的生长达到最大，此时为最佳的接种量，即100 mL发酵液中加入100 uL菌液时，最有利于固氮菌的生长。

对于解磷菌来说，当接种量在50 uL～300 uL时，菌体的生长量逐渐上升，当接种量在300 uL～400 uL，菌体生长量呈缓慢下降的趋势，因此解磷菌最佳的接种量为300 uL。

对于解钾菌来说，接种量对解钾菌的生长的影响总体趋势变化不明显，当接种量在50 uL～100 uL时，菌体的生长量逐渐上升，当接种量在300 uL～400 uL，菌体生长量呈缓慢下降的趋势，当接种量为100 uL时，发酵液中菌体的生长量最佳。

图3 不同接种量对菌株发酵生长的影响Fig. 3 Effect of the different inoculum quantity on the growth of flora combination

2.3.3 转速优化

由图4可知，转速对固氮菌、溶磷菌、解钾菌生长的影响趋势一致，当转速在90 r·min-1～180 r·min-1时，随着转速的增加，菌株的生长量逐渐增加，当转速达到180 r·min-1时，发酵液的OD值达到最大，当转速继续升高时，菌体的OD值有所下降。因此当转速为180 r·min-1时为固氮菌、溶磷菌、解钾菌生长的最佳转速。

图4 不同转速对菌株发酵生长的影响Fig. 4 Effect of the different revolution on the growth of flora combination

2.3.4 培养温度的优化

从图5可以看出，温度过高过低都不利于菌株的生长。温度对固氮菌、溶磷菌生长的影响趋势一致，当温度在22℃～30℃范围内，菌体的生长量呈逐渐上升的趋势，当温度在30℃～38℃范围内 ，菌体的生长量呈缓慢下降的趋势，当温度为30℃时，菌体的生长量达到最大，因此固氮菌、溶磷菌最佳的发酵温度为30℃。

对于解钾菌来说，当温度22℃～34℃范围内，菌株的生长量呈上升的趋势，当温度在34℃～38℃范围内，菌株的生长量略微有所下降，当温度为34℃时菌体的生长量达到最大，此时为解钾菌最佳的发酵温度。

图5 不同温度对菌株发酵生长的影响Fig. 5 Effect of the different temperature on the growth of flora combination

3 总结

综合先前的研究经验，本研究主要选择了培养基、初始pH、接种量、转速、培养温度等5个因素进行实验。通过采用单因素实验结合正交法实验对上述各因素进行优化可知，固氮菌培养基的最优组合为麦芽糖7.5 g、蛋白胨15 g、NaH2PO4·H2O 0.3 g、K2HPO40.5 g、FeCl30.2 g、MgSO4·7H20.5g，最佳pH6.8，最佳接种量为100 mL，最佳转速为180 r·min-1最佳发酵温度为30℃，此时菌体的生长量最大，OD600为1.085。利用基础培养基发酵时固氮菌的OD600 0.832，因此优化后的培养基的发酵效率比基础培养基的发酵效率提高了30.4%。溶磷菌培养基的最优组合为麦芽糖7.5 g、蛋白胨15 g、NaH2PO4·H2O 0.3 g、 K2HPO40.5 g、 FeCl30.5 g、

MgSO4·7H20.5 g，最佳pH值6.4，最佳接种量为300 mL，最佳转速为180 r·min-1最佳发酵温度为30℃，此时菌体的生长量最大，OD600为1.032。利用基础培养基发酵时固氮菌的OD6000.753，因此优化后的培养基的发酵效率比基础培养基的发酵效率提高了37.1%。解钾菌培养基的最优组合为甘露醇7.5 g、牛肉膏15 g、NaH2PO4·H2O 0.3 g、K2HPO40.5 g、FeCl30.5 g、MgSO4·7H20.5 g，最佳pH值7.6，最佳接种量为100 mL，最佳转速为180 r·min-1最佳发酵温度为34℃，此时菌体的生长量最大，OD600为0.542。利用基础培养基发酵时固氮菌的OD6000.268，因此优化后的培养基的发酵效率比基础培养基的发酵效率提高了1.02%。