血浆miRNAs 水平对肺结核的诊断价值

方 晴 叶 琴 朱育银

耐多药结核或耐利福平结核（MDR-TB/RR-TB）的发病率和死亡率下降趋势相似，结核病的早期诊断对于结核病的防治尤为重要[1]。在分枝杆菌感染期间，microRNAs（miRNAs）是免疫应答的重要调节因子[2]。miRNAs 是多种生物过程中的关键调节因子，是包括结核病在内的多种疾病诊断、治疗监测和预后的新型生物标志物[3-5]。本研究分析miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 三种血浆游离miRNAs 在诊断结核分枝杆菌感染的肺结核中的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2015 年4 月—2017 年11月于中国科学院大学宁波华美医院肺科收治的结核分枝杆菌感染的肺结核患者95 例作为病例组。根据病例组年龄、性别匹配选择同期健康体检者95 名作为对照组。两组均排除糖尿病、乙型肝炎、免疫缺陷病或其他肺相关疾病。本研究经医院伦理委员会审核通过，与所有受试者均签署知情同意书。

1.2 RNA 提取 所有受试者均取空腹肘静脉血约3mL，静置30min 后，4℃，2000r/min 离心20min，收集上清，保存于-80℃冰箱。使用TRIzol 试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA） 提 取 血 浆 中 游 离miRNAs，溶于无核酸酶水（AmbionTM，货号AM9932，批号1508254）中并保存在-80℃冰箱。

1.3 RT-PCR 分析miRNAs 表达 本研究RT-PCR的引物设计如下，miR-769-5p 上游引物：5'-GCGGCGGCTGGGATCTCCGGGGTC-3'；下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。miR-320a 上 游 引 物：5'-AAAAGCTGGGTTGAGAGG-3'；下游引物：5'-AACATGTACAGTCCATGGATG-3'。miR-22-3p 上 游 引物：5'-GGGAAGCTGCCAGTTGAAG-3'；下游引物：5'-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3'。let-7 上 游引物：5'-ACCAAGACCGACTGCCCTTT-3'；下游引物：5'-CTCTGTCCACCGCAGATATT-3'[6]。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。采用逆转录试剂盒（Fermentas，货号K1622，批号00176496） 合成cDNA，将反应混合物在16℃下孵育15min，在42℃下孵育1h，在85℃下孵育5min，并保持在4℃。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。本实验中所有检测均一式三份。let-7d、let-7g 和let-7i（let-7d/g/i）的组合用作标准化RT-PCR 数据的内源对照[6-7]，将miRNAs 的相对水平归一化至let-7d/g/i，并使用2-ΔΔCt 方法计算。

1.4 统计学方法 使用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（） 表示，采用Student's t 检验。计数资料以频数表示，采用双侧χ2检验比较组间差异。构建受试者操作特征（ROC）曲线和ROC 曲线下面积（AUC）以评估候选miRNAs 对结核分枝杆菌感染的肺结核的预测能力。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病例组和对照组一般资料比较 病例组年龄32～79 岁，平均（45.82±12.74）岁；男65 例，女30 例；体质量指数（BMI）为（20.15±2.24）kg/m2；有结核病治疗史24 例。对照组年龄30～75 岁，平均（46.27±13.59）岁；男62 名，女33 名；BMI（22.43±2.31）kg/m2；无结核病治疗史。病例组和对照组年龄、性别等比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性；病例组患者BMI 显著低于对照组（P＜0.01）。

2.2 不同年龄层、性别间血浆miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比较 不同年龄层、性别间血浆miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1-2。

2.3 病例组与对照组血浆miR-769-5p、miR-320a和miR-22-3p 水平比较 病例组患者血浆miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平均显著低于对照组（P＜0.01），见表3。

表1 不同年龄间血浆miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比较

表1 不同年龄间血浆miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比较

组别年龄＞60 岁年龄≤60 岁t 值P 值例数63 127 miR-769-5p 10.36±10.27 12.00±11.75 0.94 0.35 miR-320a 629.11±326.90 596.97±358.85 0.60 0.55 miR-22-3p 0.42±0.22 0.45±0.24 0.83 0.41

表2 不同性别间血浆miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p水平比较

表2 不同性别间血浆miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p水平比较

组别男性女性t 值P 值例数127 63 miR-769-5p 11.69±11.47 10.98±10.95 0.48 0.68 miR-320a 476.72±269.60 530.10±340.13 1.09 0.28 miR-22-3p 0.38±0.19 0.42±0.25 1.12 0.26

表3 肺结核患者与健康体检者血浆miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比较

表3 肺结核患者与健康体检者血浆miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比较

组别病例组对照组t 值P 值例数95 95 miR-769-5p 1.25±0.35 19.88±5.36 33.81<0.01 miR-320a 398.65±56.64 801.52±77.85 40.79<0.01 miR-22-3p 0.31±0.15 0.54±0.22 8.42<0.01

2.4 血浆miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平诊断结核分枝杆菌感染的肺结核 为评价所选择的血浆miRNAs 对结核病患者和健康对照者的鉴别作用，采用整个样本集进行ROC 曲线分析。ROC 曲线分析结果显示，血浆miR-769-5p 水平诊断结核分枝杆菌感染的肺结核的AUC 为0.92，灵敏度为88.42%（95%CI：80.23%-94.08%），特异度为73.68%（95%CI：63.65%-82.19%），cut-off 值为4.85（miRNA/let-7）。血浆miR-320a 水平诊断结核分枝杆菌感染的肺结核的AUC 为0.84，灵敏度为80.00%（95%CI：70.54%-87.51%），特异度为78.95%（95%CI：69.38%-86.64%），cut-off 值为506.5（miRNA/let-7）。血浆miR-22-3p 水平诊断结核分枝杆菌感染的肺结核的AUC 为0.70，灵敏度为63.16%（95%CI：52.64%-72.83%）， 特 异 度 为68.42%（95% CI：58.08% -77.58%），cut-off 值为0.39（miRNA/let-7），见图1。

3 讨 论

研究显示，人血清和血浆中的miRNA 相对稳定[8-9]。血浆miRNA 不仅来自循环血细胞，还来自其他受疾病影响的组织[10]。此外，在各种细胞类型的微泡中也存在miRNA[11]。由此说明，细胞的主动分泌是血清和血浆中发现的miRNA 的主要来源，也进一步支持了血清和血浆miRNA 谱是生物学功能指标的假设。对血浆和血清miRNA 表达模式的广泛研究可能有助于建立与组织中的病理过程相关的miRNA谱，并评估可能有助于理解疾病机制的循环miRNA。

研究者发现，结核病患者miR-769-5p 的表达水平低于健康人，与本研究结果一致[12]。研究显示，在MCF-7 乳腺癌细胞复氧后，miR-769-3p 降低N-myc下游调节基因1 的表达，而miR-769-3p 的过表达会增强细胞凋亡[13]。此外，miR-769-5p 可与其它miRNAs联合应用于胰腺癌和非小细胞肺癌的预后[14]。本研究发现，肺结核患者血浆miR-320a 表达下调，与Cui等[12]研究结果一致。目前其机制并不清楚，笔者推测miR-320a 表达降低可通过重新激活肺组织中的细胞迁移和增殖来促进疾病的进展。本研究结果还发现，相比健康对照组，肺结核患者血浆中的miR-22-3p 水平下调。研究显示，miR-22 通过磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）3'UTR 上的特定位点直接下调磷酸酶和张力蛋白同源物水平，并通过微调PTEN/AKT/FoxO1 途径的动力学起作用[15]。在内皮细胞中，细胞外尿苷三磷酸（UTP）和三磷酸腺苷（ATP）通过miR-22 减弱细胞间黏附分子1（ICAM-1）的表达和白细胞黏附[16]。为了理解miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 在结核病患者中独特表达模式的重要性，需进一步研究这些miRNA，以鉴定循环miRNA的靶基因及其机制，通过调控miRNAs 的表达来控制和预防病情的发展。

图1 ROC 曲线诊断结核分枝杆菌感染的肺结核疾病

本研究结果显示，血浆miR-769-5p 水平诊断结核分枝杆菌感染的肺结核的AUC 高达0.92，且灵敏度为88.42%，特异度为73.68%，从中可以看出血浆miR-769-5p 具有较高的诊断价值。同时，我们还分析了血浆miR-320a 水平，结果显示诊断肺结核的AUC 为0.84，敏感度和特异度分别为80.00%和78.95%，也具有较高的诊断价值。另外，血浆miR-22-3p 也显示出了较高的诊断价值，AUC 达到0.70，灵敏度和特异度均超过了60%。由于本研究样本量较少，可能存在较大误差，因此需要进一步扩大样本量进行验证。

综上所述，血浆游离miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 对于预防和诊断结核分枝杆菌感染的肺结核可能具有潜在的应用价值。